2017 Fiscal Year Annual Research Report
Study for functional mechanism of membrane protein complexes from the perspective of self-organization using single molecule direct observations.
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16H05122
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| Research Institution | International University of Health and Welfare |
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Principal Investigator |
相馬 義郎 国際医療福祉大学, 薬学部, 教授 (60268183)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 膜蛋白複合体 / 抗原ー抗体反応 / 分子間相互作用 / １分子直接観察 / 高速原子間力顕微鏡 / 脂質２重膜 / ラフト / アクアポリン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
医学・生理学的に重要な生命プロセスの多くは、必要に応じて生体膜上で機能性膜蛋白が集合して形成された膜蛋白/脂質ラフト高次機能複合体によって遂行されている。この動的な膜蛋白複合体の動作機構の解明は、医学生理学の大きな進歩に繋がると期待されるが、直接的な測定データが乏しく、その分子レベルでの動的なメカニズムについてはほとんど解っていない。本研究では、機能中の膜蛋白複合体の分子動態の直接的動画観察を可能にする高速原子間力顕微鏡（高速AFM）システムを開発し、膜蛋白/脂質間の相互作用に基づいた動的秩序形成および自己組織化の視点から膜蛋白複合体形成・解離と機能発現の動的連関メカニズムを解明することを目的とする。
そのためにまず、各膜蛋白の機能を保持したままでの発現・精製系の確立、膜蛋白複合体が生体膜中と同様な動態を示すための細胞膜環境観察プラットフォームの開発および、膜蛋白分子間相互作用についての１分子動画データの解析技術の確立に挑戦した。
研究試料としては、嚢胞線維症Cystic Fibrosis 原因遺伝子産物であるCystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator (CFTR)および水チャネルAquaporin (AQP)の一種であるAQP4を軸として、これらと機能的に深い関係があると考えられる上皮型 Na+ チャネル（ENaC）や ATP 感受性 K+チャネル（KATP）等を選定した。
AQP4およびCFTRを人工脂質2重膜に組み込んだ状態での高速AFM観察に成功した。さらにAQP4およびCFTRの抗体を投与して、それらの抗体結合・解離動態の直接観
察にも成功している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1) AQP4に対する抗AQP4抗体の巨視的レベルでの結合・解離動態と高速AFMを用いた１分子レベルでの結合・解離動態を詳細に比較検討した結果、定量的な整合を取ることできなかったことから、１分子レベルと巨視レベルとの間のメゾスコピックな領域において、分子間相互作用に関する未知の重要な分子動態プロセスが起こっている可能性が示唆された。このことを受けて、まず、AQP4アレイに近接して複数の抗体が結合した場合の、相互作用による抗体解離促進と、アレイ上のある一点（抗原)に抗体が結合した場合に、その近接した抗原への新たな抗体の結合の阻害に、抗体のアレイ上のウォーキングを加味した大規模シミュレーションを計画した。このシミュレーションには、強大な計算パワーを必要とするため、NVIDIA社製GPUを利用した超並列デスクサイドスパコンを購入、シミュレーションモデルのプログラミングを行なっている。
2) 高速AFM用の細胞膜環境観察プラットフォームを開発については、AFM観察ステージのマイカ表面と脂質２重膜の間に潅流液の層を作るために直鎖構造PEG 脂質誘導体を添加して、この効果を高速AFMで組み込まれた膜蛋白の挙動を観察すること評価してきた。しかし、この方法は間接的な評価であり、さらに広範囲により直接的に評価するために、AFMステージ上に近接場光を展開することを計画・準備中である。
3) 将来的に本研究の重要な研究対象となる病因性CFTR変異体、特に日本人・アジア人に特有な変異体の研究も並行して行なった。
以上のように、当該研究を計画した当時には予想できなかった展開となってはいるが、最終目標達成のために研究を粛々と進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
1) 機能を保持した状態での各膜蛋白の精製試料を、より高効率で得るために、前年度からナノディスクを導入した。今後も発現・精製システムの改良を続ける。
2) 細胞膜環境観察プラットフォームを改良するための、PEG 脂質誘導体の添加やリン脂質の種類の変更等の効果を評価するため、それに加え、膜複合体の動態観察の新しい測定パラメータとして、AFM観察ステージ上の近接場光展開の計画を進める。
3) １分子－巨視レベル間のメゾスコピックな領域において、分子間相互作用に関する未知の重要な分子動態プロセスが起こっている可能性がある。次のステップとして自己組織化などを含めたメゾスコピック領域での分子動態の理論的な研究に挑戦する。
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