2017 Fiscal Year Annual Research Report
Development of new therapy for neuromyelitis optica using its animal models and anti-AQP4 antibodies.
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16H05134
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
阿部 陽一郎 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (10317331)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
高井 良樹 東北大学, 大学病院, 医員 (40725743)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | アクアポリン４ / 視神経脊髄炎 / モノクローナル抗体 / 動物モデル / 抗体医薬 / 内在化／エンドサイトーシス / 自己免疫疾患 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
I. 視神経脊髄炎モデル動物によるキメラ抗体の治療効果の証明
ゲノム編集による遺伝子改変技術を用いてアクアポリン４ヒト化ラットの作製を開始し、３回のトライの後目的の遺伝子型をヘテロで持つ雄１個体を得た。これを野生型雌に対して戻し交配を行っている。また、このラットを作製する過程において、アクアポリン４欠損であると予想される遺伝子欠損を持った個体も得た。このラットも視神経脊髄炎モデル作製に寄与できると考えられたため、同様に繁殖を行っている。こちらのラットのうちアクアポリン４欠損であると予想される系統については、野生型雌に対して戻し交配を行った結果、遺伝子欠損をヘテロで持つ雄、雌各２個体ずつを得たため、これらを交配し、ホモ個体の作製に入った。
II. 抗体依存的アクポリン４内在化機構の解明とその視神経脊髄炎病態・治療における位置付け
前年度の結果からアクアポリン４タンパク質はカルボキシル末端を欠損させると発現量の低下がみられ、これがプロテアゾームの阻害剤により増加したことからプロテアゾームによる分解を受けている可能性が示唆されたが、予想されるユビキチン化部位の変異導入によっても発現量が回復しなかったことからユビキチン化の関与はないと予想された。一方、カルボキシル末端部位の詳細な検討により少なくともこのドメインに小胞体から細胞膜への輸送に必要なシグナル、細胞膜に留まるためのシグナル、細胞膜からライソゾームへと輸送されるためのシグナルの少なくとも３つのシグナルが存在する可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
ラットのゲノム編集では約300 bpのノックインという困難な遺伝子操作にチャレンジしたこと、またLewisラットという産仔数が比較的少ない系統を使用したこともあり３回目のトライアルによりようやく目的のラットが得られたこと、また、通常は12週で性成熟するラットが16週齢を超えても妊娠が成立しなかったこと等が重なり、モデルラットの確立が予定よりも遅れている。
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| Strategy for Future Research Activity |
I. 視神経脊髄炎モデル動物によるキメラ抗体の治療効果の証明
① アクアポリン４ヒト化ラットの繁殖: アクアポリン４ヒト化ラットを戻し交配後、目的遺伝子を持つヘテロ個体同士の交配によりホモ個体を作製する。また、このラット作製の過程により得られたアクアポリン４欠損であると予想されるラットも同様に繁殖しホモ個体を得る。得られたラットが確かにアクアポリン４欠損であるか否かをウェスタンブロッティング等で確認する。②アクアポリン４ヒト化ラットを用いた視神経脊髄炎モデルの作製: ホモ個体が得られたら東北大学と共同で申請者らが既に作製済みのヒトアクアポリン４の細胞外ドメインを選択的に認識するモノクローナル抗体、もしくは患者血清由来の本疾患特異的自己抗体（NMO-IgG）が、このラットによる実験的自己免疫性脳脊髄炎モデルにおいて視神経脊髄炎様病変を誘導できるか否か確認する。③ヒトアクアポリン４選択的キメラモノクローナル抗体による視神経脊髄炎治療効果の確認: 上記②のモデルができたら定常領域をヒト化したヒト選択的アクアポリン４細胞外ドメイン抗体によるin vivoにおける治療効果を評価する。
II.抗体依存的アクアポリン４の内在化機構の解明と視神経脊髄炎病態・治療における位置づけ
抗体刺激に伴うアクアポリン４内在化機構の分子レベルでの解析：昨年度の検討により、アクアポリン４のカルボキシル末端領域の部分欠損変異体の解析からアクアポリン４の抗体依存的内在化及びライソゾームへの輸送に重要と思われる領域が絞り込まれてきているが、同時に大幅な欠損によるアクアポリン４タンパク質の局在・細胞膜への輸送及び安定性への影響も同時に見られたことから、より詳細な欠損変異体の解析を進めるとともに、アミノ酸置換を導入した全長アクアポリン４による検討を行う。細胞内小胞への局在については超解像度顕微鏡も用い詳細に検討する。
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Research Products
(4 results)
