2017 Fiscal Year Annual Research Report
Elucidation of mechanisms and significance of Ca2+ channel-epigenetics coupling
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16H05140
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
森 泰生 京都大学, 工学研究科, 教授 (80212265)
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2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | カルシウムチャネル / TRPチャネル / エピジェネティクス / タンパク質複合体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Ca2+チャネル－エピジェネティックス連関における要である、電位依存性Ca2+チャネル副サブユニットであるbetaサブユニットの役割を引き続き解明した。まず、電位依存性Ca2+チャネルbetaサブユニットによるWnt－beta cateninシグナル経路の調節に関する解析を進めた。核内において、betaサブユニットは転写因子であるTCF4と結合することにより、TCF4とbeta catenin との相互作用を妨げることがわかってきた。その結果、betaサブユニットはWnt－beta cateninシグナル経路による遺伝子転写制御を阻害することがわかった。また、以前から解析を続けてきたphosphatase 2A (PP2A)の活性制御サブユニットであるB56deltaと電位依存性Ca2+チャネルbeta4サブユニットが形成する複合体の生理的意義の解明も進めた。本複合体が核に移行し、G1/S期の遷移をしんこうさせ、細胞増殖を増進させることがわかってきた。さらに、活性酸素種H2O2に高感受性のTRPM2チャネルに関しては、唾液腺の放射線損傷をCa2+依存的なcaspase-3活性を増強することにより引き起こすことが明らかになった。その際には、TRPM2チャネルの活性が、他のCa2+流入経路（特にCa2+ストア枯渇依存性Ca2+チャネル）と連関していることが重要であることも示した。既に、TRPM2チャネルがNMDA受容体やTRPM2チャネルタンパク質の非常に特徴的な他Ca2+チャネルタンパク質との分子的及び機能的相互作用が、徐々に明らかになりつつあり、電位依存性Ca2+チャネルとも連関する可能性が高くなってきた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
課題1（イオンチャネル－エピジェネティックス連関の新規分子機構の探究）においては、beta4－HAT1相互作用の解析、およびそれを中心とした複合体の解析が順調に進行している。細胞質画分と核画分それぞれに着目し、 核移行で複合体がどう変化するかの基本的知見も得つつある。実際に会合が生じているかを、蛍光タンパク質間のFRETの細胞内観察により確認しつつある。また、膜電位の脱分極による表面膜の電位依存性Ca2+チャネル複合体からのbetaサブユニットの脱離に関しては、全反射蛍光顕微鏡による観察にも成功し、論文作成に進めている。さらに、質量分析により、新たなbeta4会合タンパク質としてシャペロンタンパク質が得られている。課題2（イオンチャネル－エピジェネティックス連関の生物学的意義の探究）においては、まず、beta4遺伝子の第4エクソンの欠失により、SH3及びGuanylate Kinase領域などの重要領域を全て欠くbeta4変異体が産生されるデザインとなっているbeta4サブユニットの条件的KOマウスの作製が順調に進んでいる。また、海馬スライスからの多点神経活動電位の測定からの興味深いデータも得られつつある。以上の点から、計画は概ね順調に進行していると判断できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
複合体の構成タンパク質の発現・機能の欠失・阻害により、分子機構・シグナル伝達にどのような変化・異常が生じるかの解析を引き続き行う。ここでは、beta4サブユニットのFloxed条件的KOマウスにTamoxifen誘導性のCre遺伝子導入によるbeta4の欠失等の処理を加えた培養神経細胞を調製し、複合体の形成、核移行の変化・異常の解析を引き続き行う。また、どの遺伝子とのクロマチン形成に寄与するヒストンH3・H4のアセチル化 (或いはH3リン酸化)が影響を受けるかを解明するための、抗ヒストンH3アセチル化（H3リン酸化）抗体を用いたクロマチンの免疫沈降とそれに含まれるゲノムDNAの配列解析（ChIP－seq）を行う。また、裏付けとして遂行する、beta4サブユニットを含む会合体が制御する遺伝子を明確にするために抗beta4抗体を用いたChIP－seqも遂行する。さらに、beta4サブユニットのFloxed条件的KOマウスにCA3領域錐体細胞選択的にCreリコンビナーゼを発現するマウスとの掛け合わせ、海馬の錐体細胞に、それもCA3領域に選択的なノックアウトマウスを作製する作業も進める。多点電極計測（MED）システムにより、海馬スライスにおける神経活動も解析する。
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Research Products
(5 results)
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[Journal Article] Down-regulation of the Wnt/β-catenin signaling pathway by Cacnb4.2017
Author(s)
Rima M, Daghsni M, Lopez A, Fajloun Z, Lefrancois L, Dunach M, Mori Y, Merle P, Bruses JL, De Waard M, Ronjat M
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Journal Title
Mol. Biol. Cell
Volume: 28
Pages: 3699-3708
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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