2017 Fiscal Year Annual Research Report
Elucidation of physiological roles of NLRP3 phosphorylation in the NLRP3 inflammasome formation
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16H05178
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
森田 林平 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 准教授 (00362541)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | インフラマソーム / NLRP3 / 炎症 / タンパク相互作用 / ミトコンドリア |
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| Outline of Annual Research Achievements |
LPS刺激マウス骨髄マクロファージのNLRP3を免疫沈降法により回収し、質量分析によりNLRP3のリン酸化部位の同定を試みた。しかし全長のNLRP3アミノ酸配列をカバーすることは予想以上に困難であった。一方、昨年度作製したBTK-KO THP-1細胞クローンではNLRP3インフラマソームの活性化が低下していることが確認できた。
一方、本研究と並行してLPS刺激マウス骨髄マクロファージ中のNLRP3の結合因子を免疫沈降と質量分析により複数同定した。その中でもF-actin調節因子gelsolinに着目して研究を進めた。Gelsolin遺伝子（Gsn）欠損J774-1細胞（マウスマクロファージ株）クローンではnigericin刺激により過剰のcaspase-1の活性化とpyroptosisの誘導が認められた。即ち、gelsolinはNLRP3インフラマソームの形成抑制因子であることが示唆された。加えて、Gsn欠損J774-1細胞ではcaspase-3の活性化も亢進していた。つまりgelsolinはマクロファージの2種類のプログラム細胞死apoptosisとpyroptosisを制御し、炎症環境下でのマクロファージ死を抑制していると考えられる。
その生理的意義を明らかにするため、CRISPR/Cas9システムを用いてGsn-floxedマウスの作製に着手した。現在PCRスクリーニングにより子マウス中にGsn-floxed founderマウスが存在するか確認している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の目的であるNLRP3リン酸化修飾については技術的な改善が必要であるが、その一方で、LPS刺激マクロファージ中のNLRP3と相互作用する細胞内分子を複数同定した。中でもgelsolinがNLRP3インフラマソームの形成抑制因子であることを見出し、炎症環境下でのマクロファージの生存を促しているというユニークな機能を発揮している可能性を見出した。更に、その生体内での生理的意義の解明に向けて、遺伝子改変マウスの作製に着手できたため。
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| Strategy for Future Research Activity |
先ず、gelsolinのNLRP3インフラマソーム形成抑制の分子機序を解明する。特にNLRP3インフラマソーム形成の場であるミトコンドリアとの関連に焦点を当てる。具体的にはNLRP3インフラマソーム活性化の際にgelsolinが結合するミトコンドリア膜上の分子を同定し、その後同定された分子の欠損J774-1細胞クローンを作製する。その後インフラマソームの活性誘導に対するプログラム細胞死を評価する。
上記と並行して、Gsn-floxed founderマウスよりマクロファージ特異的Gsn欠損マウスを作製し、炎症モデル（敗血症、痛風、接触性皮膚炎）実験を施行する。野生型及びNLRP3欠損マウスと比較する。一方、腫瘍浸潤マクロファージに対する機能を解明するために、担がんマウスの作製も行う。
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[Journal Article] Notch-mediated conversion of activated T cells into stem cell memory-like T cells for adoptive immunotherapy2017
Author(s)
Kondo T, Morita R, Okuzono Y, Nakatsukasa H, Sekiya T, Chikuma S, Shichita T, Kanamori M, Kubo M, Koga K, Miyazaki T, Kassai Y, Yoshimura A
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Journal Title
Nature Communications volume
Volume: 8
Pages: 15338
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Multiomic disease signatures converge to cytotoxic CD8 T cells in primary Sjogren's syndrome.2017
Author(s)
Tasaki S, Suzuki K, Nishikawa A, Kassai Y, Takiguchi M, Kurisu R, Okuzono Y, Miyazaki T, Takeshita M, Yoshimoto K, Yasuoka H, Yamaoka K, Ikeura K, Tsunoda K, Morita R, Yoshimura A, Toyoshiba H, Takeuchi T
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Journal Title
Annals of the Rheumatic Diseases
Volume: 76
Pages: 1458-1466
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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