2016 Fiscal Year Annual Research Report

Elucidation of the mechanisms of RON3 during sporozoites invasion of hepatocytes

Research Project

Project/Area Number	16H05182
Research Institution	Ehime University
Principal Investigator	石野智子愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 准教授 (40402680)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	橘真由美愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 助教 (00301325) 鳥居本美愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 教授 (20164072)
Project Period (FY)	2016-04-01 – 2019-03-31
Keywords	マラリア / スポロゾイト / RON3
Outline of Annual Research Achievements	マラリア原虫スポロゾイトが肝細胞に感染する際に、原虫タンパク質RON3がどのような作用機序で関わるのか、さらには、RON3と相互作用する宿主細胞分子の同定を行うことで、肝細胞侵入のメカニズムを明らかにしようとする研究課題である。 RON3の役割を肝細胞寄生に限定して詳細に解析する目的で、細胞通過（寄生する為でなく通り抜ける為に標的細胞の膜に障害を与えながら侵入する）に必須な原虫分子であるSPECT2を欠損させた遺伝子改変原虫に、さらにRON3のスポロゾイト時期特異的発現抑制コンストラクトを導入した。得られたSPECT2-KO/RON3-cKD (conditional knock-down)原虫の肝細胞侵入／寄生胞膜形成／肝細胞内発育の効率をコントロール原虫(SPECT2-KO)と比較した。さらに、様々な変異型RON3発現コンストラクトを導入する為に、薬剤耐性カセットを持たないRON3-cKD原虫の作製が順調に進められた。これまでに、positive/ negative選択の為のカセットを含むRON3-cKD原虫を作出し、既に作出済みのRON3-cKD原虫と同じ表現型を示すことが確認された。次に、選択マーカーをGFPの発現カセットに入れ替えるための組換えベクターを作出済みである。変異型RON3をスポロゾイトでのみ効率よく発現させる為のプロモーターを探索する目的で、スポロゾイト時期に多く発現する原虫タンパク質のプロモーター活性をmCherryを指標として解析した。RON3の発現と類似する２種類のプロモーター領域を同定できた。また、スポロゾイトの肝細胞侵入を抑制する抗体を２種類作製した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 変異型RON3を発現させる為の準備が整ったといえる。
Strategy for Future Research Activity	計画通り、５種類の変異型RON3をスポロゾイト時期特異的に発現させる組換え原虫を作出し、それぞれのスポロゾイトの肝細胞侵入／寄生胞膜形成／肝細胞内での発育効率を解析することで、RON3のどの領域が機能に関わるのかを明らかにする。さらに、RON3の全長を網羅するような部分タンパク質を、コムギ胚芽由来無細胞タンパク質合成系で作製し、宿主細胞タンパク質と結合する領域を免疫沈降法により解析する。