2016 Fiscal Year Annual Research Report
宿主ユビキチンシステムを負に制御する細菌エフェクタータンパク質の解析
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16H05189
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
久堀 智子 大阪大学, 微生物病研究所, 特任講師(常勤) (20397657)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | ユビキチン / 脱ユビキチン化酵素 / レジオネラ / エフェクター / 細菌感染 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
病原細菌が宿主ユビキチンシステムを模擬して感染に有利な細胞内反応を引き起こす仕組みは、宿主ユビキチンシステムに対する正と負両面からの細菌による働きかけで成り立つと考えられる。近年の研究から、ユビキチンシステムを駆動する E3 ユビキチンリガーゼとしての活性を持つタンパク質が様々な病原細菌がコードするエフェクタータンパク質の中に存在すること、またその詳細な機能が明らかにされつつある。一方で、ユビキチンシステムを負に制御する主要な酵素である脱ユビキチン化酵素 (Deuniquitinase; DUB) については細菌タンパク質の中にまだほとんど見つかっていない。本研究課題では、極めて多彩なエフェクターレパートリーを持ち、重篤な肺炎を引き起こす病原細菌であるレジオネラから DUB を見つけ出すこと、そしてその機能や宿主感染における役割を明らかにすることを目的として研究を行っている。
本年度は、ゲノム解析からすでに申請者らが見出していた５つの DUB 候補タンパク質の中から、感染において重要な役割を果たすと考えられた一つのタンパク質 LotA について解析を行った。まず、 大腸菌発現系を使って LotA タンパク質精製を行った。精製したタンパク質と様々な結合様式を持つユビキチン鎖を用いた in virto の反応を試みた結果、LotA が DUB としての酵素活性を持つことが証明された。LotA を真核細胞に異所発現させた結果、細胞内のポリユビキチンレベルが大きく減弱することが確認された。レジオネラを宿主細胞に感染させたところ、細胞内でレジオネラを内包する液胞の周りに LotA が集積し、LotA の酵素活性依存的にユビキチンが液胞から除去されることがわかった。これらの結果から、LotA が細菌液胞上のユビキチンを除去する活性を持つことが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
DUB 候補タンパク質の中で最も重要な働きをすると考えられた一つのタンパク質が、実際に DUB としての活性を持つことを実験的に証明することができた。また、感染細胞内で細菌を内包する液胞上のユビキチンは宿主の免疫機構のターゲットとなるため細菌にとっての不利益と考えられるが、そのユビキチンを除去する活性を、見出した DUB が持つことが示された。この結果は、細菌による宿主感染機構を説明する上で、宿主ユビキチンシステムへの操作が非常に重要であることを示す一例として、本研究が位置付けられることを意味する。初年度の成果としては、計画以上の進展であったと考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
見出された DUB タンパク質の機能をさらに詳細に調べるため、各種変異体の樹立、in vitro の酵素活性解析を行う他、レジオネラ感染における意義をさらに詳しく調べるため感染細胞内でのレジオネラ増殖への影響を詳細に解析する。また、液胞上への局在から考えられる脂質結合のメカニズムについての解析を行うことを計画している。
また他の DUB 候補タンパク質についても、大腸菌発現系の構築とタンパク質精製、機能解析を進める。これらのタンパク質については感染細胞内で特定のユビキチン化されたタンパク質がターゲットとなることが想定されるため、相互作用タンパク質の探索を進めてゆきたい。具体的には、真核細胞での発現系を構築し、プルダウン法で結合タンパク質を同定するか、または酵母ツーハイブリッド系による探索を試みる。相互作用タンパク質が同定されれば、ノックアウト系を導入するなどして該当タンパク質の細菌感染における働き、およびそのタンパク質に対するレジオネラ DUB の果たす役割を解析する予定である。
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