2017 Fiscal Year Annual Research Report
Mechanisms for development of diseases by H. pylori virulence factor complex
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16H05191
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| Research Institution | Oita University |
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Principal Investigator |
山岡 吉生 大分大学, 医学部, 教授 (00544248)
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2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | ヘリコバクター・ピロリ / 外膜タンパク / タンパク質複合体 / 病原因子 / 炎症 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
OipAタンパク質の発現・精製: OipA遺伝子のコドンを大腸菌に最適化し、発現プラスミドと宿主の条件検討を行うことで、大腸菌での組換え全長OipAタンパク質の発現系を確立した。組換えOipAタンパク質は大腸菌の外膜に局在していたことから、OipAが外膜タンパク質であることを生化学的に明らかにした。また変性条件下での組換えタンパク質の精製と、リフォールディング法を確立し、大腸菌の1L培養から1mgの組換えタンパク質を得ることが可能となった。
病原因子複合体の探索: ピロリ菌の病原因子は病原因子間で相互作用しているのではないかと考え、ピロリ菌の膜タンパク質複合体の解析を行った。High resolution Clear Native PAGEで複合体を分離した後に、ゲルをCBBで染色し、タンパク質バンドごとに分割した。さらに、このゲルからペプチドを抽出し、質量分析器で解析してピロリ菌の膜タンパク質複合体を構成するサブユニットの同定を行った。その結果、OipAを特定の分子量のゲル (102-222 kDa間) から検出した。単量体OipAの推定分子量は32kDaであることから、OipAがピロリ菌の膜領域で多量体を形成しているか、または他分子と複合体を形成していることが示唆された。
ピロリ菌膜内でのOipA相互作用分子の探索: 精製した組換えOipAタンパク質からウサギポリクローナルOipA抗体を作製し、これを用いた免疫沈降によりOipAの相互作用分子の探索を行った。野生株とoipA欠損株の免疫沈降サンプルをSDS-PAGEゲルで比較解析したところ、野生株ではOipAタンパク質は抗体により検出され、さらに共沈降されたタンパク質もみられた。このことから、ピロリ菌内でOipAは他の分子と相互作用していることが考えられ、現在は条件検討により相互作用分子の候補を絞っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ピロリ菌内でOipAは他の分子と相互作用していることが考えられることがわかり、発展性がでてきたこともあり、おおむね順調に進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
ピロリ菌内でOipAが他の分子と相互作用していることが考えられたため、現在は条件検討により相互作用分子の候補を絞っている段階で、期間終了時までには、相互因子を解明して、ブレークスルーを図りたい。
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