2017 Fiscal Year Annual Research Report

Attempt to regenerate skin appendages using reconstituted embryonal-like skin equivalent using human induced pluripotent stem cells

Research Project

Project/Area Number	16H05370
Research Institution	Kyorin University
Principal Investigator	大山学杏林大学, 医学部, 教授 (10255424)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	高橋良杏林大学, 医学部, 講師 (00317091) 佐藤洋平杏林大学, 医学部, 助教 (90736307)
Project Period (FY)	2016-04-01 – 2020-03-31
Keywords	ヒト皮膚再生 / ヒトiPS細胞 / 付属器再生 / 分化誘導
Outline of Annual Research Achievements	研究２年目となる本年度は１）分化度の異なるヒトiPS細胞由来上皮・間葉系細胞をもちいた３次元皮膚構造の作成　２）培養皮膚の表皮―真皮結合部で器官誘導シグナルの発現強度が高くなるin vitro条件の検討　３）ヒトiPS細胞を用いた付属器誘導の足がかりとなる細胞シードの作成　４）３次元培養皮膚へのヒト毛乳頭細胞塊の組み込み培養を行った。１）に関して現在採用している３次元培養系ではヒトiPS細胞由来上皮細胞（ケラチノサイト）の分化度を高めた方がより確実に表皮構造を再現できることが明らかとなった。また、真皮相当コラーゲンゲルへの組み込み効率を若干改善することができたが、この方法でもiPS細胞由来の間葉系幹細胞と線維芽細胞とでは後者の方が真皮構造を再現する確立が高かった。２）の段階は昨年度は細胞障害により遂行できなかったが、正常ケラチノサイトと線維芽細胞を用いて作成した３次元構造像体に二種類のWNTシグナル活性化因子を作用させ組織障害なく毛盤様構造を再現できた。また、得られた組織では毛誘導に関連するいくつかの遺伝子の発現が増強していた。３）についてヒトiPS細胞から毛乳頭様細胞を分化誘導し遠心法にて細胞塊を作成し、WNT、BMP、FGF活性化因子を用いた毛乳頭特性付与培地にて維持培養し毛乳頭細胞関連マーカー発現を確認した。４）では正常ヒトケラチノサイト、線維芽細胞およびヒトiPS細胞由来ケラチノサイト、線維芽細胞で構築した３次元培養皮膚にヒト毛乳頭細胞塊を組み込む実験を行った。発現強度は特にヒトiPS細胞を用いた場合には低いもののTRPS1などの毛包関連マーカー遺伝子発現を確認することができた。以上から、今後ヒトiPS細胞由来細胞で構成された３次元培養皮膚を発生に類似した状態におき器官発生を模した反応を得るための技術的基盤のいくつかを確立することができた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason これまでの計画遂行を通じて明らかとなった解決すべき二つの課題のうち、ヒトiPS細胞から誘導した上皮、間葉系細胞を用いた3次元構造の作成法に関しては未だ改良の余地こそあるものの、使用細胞数の適正化などにより安定化しつつある。しかし、研究計画申請時の予想とは異なり、現在のところヒトiPS細胞からケラチノサイトや線維芽細胞方向に分化度を高めた細胞を用いた方が3次元培養皮膚を安定して作成できることが明らかになりつつある。これは幼弱な細胞により組織再構築を試み、それ全体をさらに分化誘導するという本研究計画の発想にややそぐわない結果である。また現在の実験系の遂行には予想以上に大量の細胞が必要であり、ヒトiPS細胞の誘導開始から3次元構造体作成まで2ヶ月弱要することを考えると現在の培養皮膚作成法と並行して他法も検討する必要があると思われた。一方、昨年度、細胞障害の問題から昨年度遅れた器官誘導シグナル系活性化因子を用いて表皮―真皮結合部で器官誘導シグナルの発現強度を高める方法の開発に関して本年度は進展があった。WNT、SHHの二つのシグナル系活性化因子をヒトケラチノサイト、線維芽細胞から作成した3次元培養皮膚に作用させ、DKK4、EDAR、FGF20などの毛包発生関連マーカーの遺伝子発現が増強する傾向を確認することができた。また、WNT活性化因子を作用させた際にはケラチノサイトが凝集し真皮部分から隆起する毛盤のような構造が見られた。作用させる因子ごとに異なる構造が形成されたことから、複数の因子の組み合わせにより相乗効果が得られる可能性が示唆された。以上より、昨年度最優先としてあげた二つの課題を進めることができた。しかし、当初の予想と異なり現在使用中の3次元立体培養皮膚の再構成系に加えて新しい系を模索する必要も生じたことから申請当初の予定と比較すると計画はやや遅れていると判断した。
Strategy for Future Research Activity	今後の研究計画の推進課題として、１）器官誘導シグナルの発現強度を高める方法のさらなる開発　２）3次元培養系の改良、それと並行した代替法の模索　があげられる。１）に関して、正常ヒトケラチノサイト、線維芽細胞を用いた3次元培養皮膚モデルを用いた、異なる因子の組み合わせと新規因子の追加導入による器官発生シグナルの更なる増強を目指す。具体的にはWNT、SHHシグナリング系活性因子に加えて、毛包発生に重要なEDA、BMPおよびFGFシグナル経路の活性因子を3次元培養系に添加し器官発生関連マーカーの発現を評価する。さらに複数の因子を組み合わせて添加することで最も器官発生関連マーカーの発現が増強する条件を確定する。次いでヒトiPS細胞から誘導した上皮、間葉系細胞の混合培養系に上記で確定した因子のカクテルを作用させ器官発生関連マーカーの発現を検討する。また、毛包発生はいくつかの段階に分かれるため独創的な試みとしてWNT-EDA 、SHH-FGFなど活性化因子の組み合わせをつくり、段階的に作用さ器官発生関連マーカーの発現に変化があるか検証する。２）は本研究を進める上で基本となるプラットフォームの改良であり重要である。現在の問題点としてまだヒトiPS細胞から誘導した細胞を用いた際の3次元培養皮膚の組織構築の完成度が低いこと、作成に多くの細胞と時間を要する欠点がある。改良の方策として作成する3次元培養の小型化、真皮相当部分への上皮細胞播種法、構成細胞の変更を考えている。当初の計画では真皮部分はヒトiPS細胞から分化誘導した間葉系未分化細胞をコラーゲンに混合し作成することとしていた。現在、真皮部分の再構成が課題であることから、使用細胞を毛乳頭と同等の機能を有する細胞に置換するなどを試みる。また並行してマトリゲルに上皮、間葉系細胞を混合封入するなど別法を用いた3次元構造の再構築を試みる。