2018 Fiscal Year Annual Research Report
Attempt to regenerate skin appendages using reconstituted embryonal-like skin equivalent using human induced pluripotent stem cells
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16H05370
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| Research Institution | Kyorin University |
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Principal Investigator |
大山 学 杏林大学, 医学部, 教授 (10255424)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
高橋 良 杏林大学, 医学部, 講師 (00317091)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ヒト皮膚再生 / ヒトiPS細胞 / 付属器再生 / 分化誘導 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
研究３年目では１）３次元立体培養皮膚にかわる立体構造再現法の確立 ２）再構成組織における器官発生シグナル評価のための器官形成マーカーの上皮、間葉系細胞における発現様式の検討 ３）培養皮膚の表皮―真皮境界部で器官形成シグナルの発現を向上するための培養条件の検討 ４）１）で確立した方法へのヒトiPS細胞由来細胞への導入の可能性の評価を行った。
１）に関して、代替法の開発では、マトリゲルに器官形成の足場を鋳型様にモールドし、毛乳頭類似シードを封入後、その上に上皮細胞（ケラチノサイト）を注入し毛包に類似した３次元構造を再現する系の確立を試みた。ヒト正常ケラチノサイトと、毛乳頭細胞からから作成した細胞塊を用いた実験では毛包、特に毛球部に類似した構造を再現することができた。再構成された構造体毛包は毛包特異的に発現するAE13を発現していた。本法は従来法と比較して少ない細胞数で実施可能かつ安定であり、今後、主として本法を採用していくことが望ましいことを確認した。
２）に関して、本研究で再構成される立体構造を用いて器官発生マーカーの遺伝子発現の程度を比較する場合、組織を構成する両系統の細胞の割合により補正する必要があることが明らかとなり個々のマーカーの系統特異性を評価した。
３）では２）の段階で得た知見を活用し、３次元培養皮膚の系を用いてWNT、SHH、EDAシグナル系の活性因子を組合せると相補的に働き、器官発生シグナルを効果的に発現増強できることを確認した。
４）では２系統のヒトiPS 細胞から研究計画に沿ってケラチノサイト、間葉系幹細胞由来毛乳頭相当細胞塊を作成した。１）にて新たに確立した実験系に誘導した細胞を導入し、今後の研究計画が遂行可能か否かにつき評価した。少なくとも現段階ではヒトiPS細胞由来毛乳頭相当細胞塊は本系に応用可能である可能性が高いことが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本年度は研究計画において新たなる進展があった。新規実験プラットフォームの開発である。これまで本研究計画で使用してきた３次元培養皮膚法では、特にiPS細胞を使用した際に、予想に反して不安定になり組織構築が崩れるという欠点があった。特に、器官発生シグナル活性化因子を作用させた場合にその傾向が顕著であった。そこでコラーゲンゲル内に器官形成の足場を鋳型様にモールドし、そこに毛乳頭細胞、あるいはヒトiPS細胞由来間葉系細胞からなる毛乳頭類似細胞塊を封入し、その上に上皮細胞（ケラチノサイト）を注入しする系の確立を試み、ヒト正常ケラチノサイトと、毛乳頭細胞からは比較的安定して毛包様の立体構造を再現できるようになった。iPS細胞由来ケラチノサイト（上皮細胞）を用いた予備実験では、まだ比較的大量の細胞が必要であるという課題は残るが、iPS細胞由来間葉系細胞については細胞塊を用いて安定した実験が可能であることを確認し得た。
器官形成シグナル活性化因子を組み合わせ、付属器発生のための上皮－間葉系相互作用が増強できるか否かの検討では、３次元培養皮膚を用いた場合に再構成組織における上皮、間葉系細胞の構成比率が異なるという技術的問題が生じたが、ケラチノサイト、間葉系細胞のマーカーの発現量をリファレンスとし、構成比率を補正し検体間で比較する解決法を見いだした。これを用いて、実験系で用いるWNT、SHH、EDAなどの個々の因子の濃度を最適化し、次いで、個々の因子が上皮―間葉系相互作用に異なった影響を及ぼし、それらを組み合わせることで相補的に相互作用を高めることができる可能性を示唆する結果を得た。
以上から、新たな組織再構築系とそこで用いる実験条件が整いつつあり、今後の円滑な研究計画の遂行の基盤を築くことができた。しかし、計画申請時のロードマップと比較すると若干の遅れは否めず「やや遅れている」と判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
3次元組織構築の再現にはシート状培養皮膚ではなく前年度に開発したコラーゲンゲルモールド法を用いる。まず、付属器発生のうち、毛包再生に焦点をあて計画を進める。
正常ヒトケラチノサイトと毛乳頭細胞を用いて毛包類似構造を再生する立体培養系にWNT、SHH、EDA系の活性化因子を作用させ、毛包類似構造とヒト毛包との形態学的類似性、毛包マーカー（特に毛包特異的ケラチン[K33a、K71 、K75、K82、K86]やTRPS1など）の発現レベルを評価する。次いで、これらの活性化因子を組み合わせ添加した条件で３次元培養し、形態学的特徴やマーカーの発現が単一因子を作用させた場合と比較して改善するかを検討し条件を最適化する。
続いて上皮系、間葉系細胞をそれぞれiPS細胞由来の細胞と入れ替え組織再構築を試みる。まず、一つのiPS細胞のラインを用いて間葉系幹細胞を経て毛乳頭様細胞に分化させ細胞凝集塊を作成し、正常ケラチノサイトと相互作用させ最適化した条件で毛包構造の再現を試みる。マーカーの発現がうまく得られない場合には因子追加などにより条件を改良する。目標達成時には、iPS細胞ラインを追加し検討する。
並行して、ヒトiPS細胞由来ケラチノサイトと正常毛乳頭細胞からなる細胞塊をもちいて同様の組織再構築を試みる。これまでの研究結果と本研究課題のテーマを考慮し、分化誘導の際に継代操作を加えないiPS細胞由来ケラチノサイトを用いて実験を行う予定である。
最終的に、上皮、間葉系細胞のいずれもiPS細胞由来とし組織構築を試みる。組織構築が安定した場合には免疫不全マウスへの移植により組織の長期安定性、生物学的特性を評価する。
毛包類似構造再生実験と並行し、ヒト皮膚より汗腺細胞、脂腺細胞を分離し同様の検討を予定しているが、まず毛包再構成に集中することとする。
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Research Products
(5 results)
