2016 Fiscal Year Annual Research Report
Study of mechanism of neurodegeneration and abnoraml protein deposition in FTLD
| Project/Area Number |
16H05379
|
|---|
| Research Institution | Aino University |
|---|
Principal Investigator |
武田 雅俊 藍野大学, 医療保健学部, 学長 (00179649)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
井出 千束 藍野大学, 医療保健学部, 教授 (70010080)
兼清 健志 藍野大学, 医療保健学部, 講師 (20525399)
田中 稔久 大阪大学, 医学系研究科, 准教授 (10294068)
森 康治 大阪大学, 医学系研究科, 助教 (40775318)
森原 剛史 大阪大学, 医学系研究科, 助教 (90403196)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
|
| Keywords | 前頭側頭型認知症 / TDP-43 / C9orf72 / XIAP / ジペプチドリピート / 内因性アポトーシス阻害因子 / 神経細胞変性 / 異常蛋白凝集 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
前頭側頭型認知症患者の詳細な神経心理検査画像検査をおこないDNAをも含めた採血を継続して収集している。血漿成分は、バイオマーカーの検討に使用する予定であり、末梢血中のｍRNAについて精度の高い測定・解析を行うための基礎的検討を行った。
TDP-43の全長および病態脳で発現しているC端フラグメント（35kDa）とC9orf72由来のジペプチドリピート蛋白（(-Gly-Ala-)nをeXactシステム (BioRad) を用いて作成を試みた。これらの蛋白は凝集性が高く抽出に困難があったために、さまざまな工夫をすることが必要であったが、最終的にコールドショック蛋白発現系に切り替えることにより作成した。
一方細胞内での結合を検討するためにC9orf72由来のジペプチドリピート蛋白（(-Gly-Ala-)n高発現HEK293T細胞株を作成し、これを固定したのちリコンビナントのGST-Tag付きXIAPをオーバーレイしてその共局在を確認しようとしたところ、ジペプチドリピート蛋白の凝集体は確認できたが、XIAPはび漫性に染色され、その結合は確認できなかった。そこで、Gly-Ala(GA)リピートタンパクの凝集と内因性XIAPが培養細胞レベルでの共局を知るためにさらに以下の実験を行った。Hela細胞に内因性C9orf72リピートおよびその近傍領域をクローニングしたプラスミドを強制発現させ、non-AUG依存性翻訳によってC末端をFLAG-TAGで標識したGly-Ala(GA)リピートタンパクを発現させた。この細胞をパラフォルムアルデヒドで固定し、抗FLAG抗体および内因性XIAP対するモノクローナル抗体を用いた2重染色を行ったが、GAタンパクの凝集と内因性XIAPの共凝集は明瞭には認められなかった。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
TDP-43の全長および病態脳で発現しているC端フラグメント（35kDa）およびC9orf72由来のジペプチドリピート蛋白（(-Gly-Ala-)nは、もともと凝集性が高いことが推察されたが、実際に抽出の際に大きな困難があった。しかしながら様々な工夫を加えることにより、コールドショック蛋白発現系に切り替えることにより作成することに成功した。このような事情からin vitroでのXIAPとの結合実験は、一部のペプチドについては結果を得ることができたが、全てのペプチドについては解析が終了していないため、引き続きの検討が必要である。
in Vivo系における共重合についても、いくつかの実験条件を検討する必要があることが明らかになったが、いずれもテクニカルな問題と推察されるので、現在実験手技の改善に取り組んでいる。
|
| Strategy for Future Research Activity |
内因性アポトーシス阻害因子であるXIAPと異常沈着蛋白(TDP-43 のC 端フラグメント（35kDa）蛋白とジペプチドリピート蛋白(-Gly-Ala-)n のN 末端)との結合実験を引き続き行ない、TDP-43 の全長および病態脳で発現しているC 端フラグメント全て（42kDa、35kDa、 25kDa）とジペプチドリピート蛋白の全て（(-Gly-Ala-)n、(-Gly-Pro-)n、(-Gly-Arg-)n、(-Pro-Ala-)n、 (-Pro-Arg-)n）についての結合特異性を検討する。XIAP との結合にはN 末端が重要であるので、eXact システム (BioRad) を用いてN 末端にタグ付きのリコンビナント蛋白を作成し、このタグをzupsitilin 付専用カラムにて結合させ、タグの切断を行って、N末端配列を厳密に作成することが重要と考えられる。また、リピート数により病態発現が変わるメカニズムを明らかにするために、Ala-Gly-(-Ala-Gly-)n のN=16 およびN=100 といったリピート数の異なるものを作成する。そして、作成されたリコンビナント蛋白とGST タグ付きのXIAP を用いてpull-down アッセイを行う。さらに結合親和性については、Biacore2000 (Biacore Inc, Sweden)を用い、表面プラズモン共鳴法によって解析する。細胞内での結合実験については、凝集のあとに事後的には結合せず凝集ステップで結合する可能性が残されていることから、共発現系にて検討を行う予定である。
|
Research Products
(33 results)
-
[Journal Article] The regulation of soluble receptor for AGEs contributes to carbonyl stress in schizophrenia.2017
Author(s)
Miyashita M, Watanabe T, Ichikawa T, Toriumi K, Horiuchi Y, Kobori A, Kushima I, Hashimoto R, Fukumoto M, Koike S, Ujike H, Arinami T, Tatebayashi Y, Kasai K, Takeda M, Ozaki N, Okazaki Y, Yoshikawa T, Amano N, Washizuka S, Yamamoto H, Miyata T, Itokawa M, Yamamoto Y, Arai M.
-
Journal Title
Biochem Biophys Res Commun. 2016 Oct 21;479(3):447-452.
Volume: 479
Pages: 447-452
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
-
[Journal Article] Heterogeneous ribonuclear protein A3 (hnRNP A3) is present in dipeptide repeat protein containing inclusions in Frontotemporal Lobar Degeneration and Motor Neurone disease associated with expansions in C9orf72 gene2017
Author(s)
Davidson YS, Flood L, Robinson AC, Nihei Y, Mori K, Rollinson S, Richardson A, Benson BC, Jones M, Snowden JS, Pickering-Brown S, Haass C, Lashley T, Mann DMA
-
Journal Title
Acta Neuropathologica Communications 5:31, 2017
Volume: 5
Pages: 31
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
-
[Journal Article] Neural Basis of Apathy in Patients with Amnestic Mild Cognitive Impairment2017
Author(s)
Kazui H, Takahashi R, Yamamoto Y, Yoshiyama K, Kanemoto H, Suzuki Y, Sato S, Azuma S, Suehiro T, Shimosegawa E, Ishii K, Tanaka T.
-
Journal Title
J Alzheimers Dis.
Volume: 55(4)
Pages: 1403-1416
DOI
Peer Reviewed
-
-
-
-
-
[Journal Article] Sleep disturbances are key symptoms of very early stage Alzheimer disease with behavioral and psychological symptoms: a Japan multi-center cross-sectional study (J-BIRD).2016
Author(s)
Kabeshita Y, Adachi H, Matsushita M, Kanemoto H, Sato S, Suzuki Y, Yoshiyama K, Shimomura T, Yoshida T, Shimizu H, Matsumoto T, Mori T, Kashibayashi T, Tanaka H, Hatada Y, Hashimoto M, Nishio Y, Komori K, Tanaka T, Yokoyama K, Tanimukai S, Ikeda M, Takeda M, Mori E, Kudo T, Kazui H.
-
Journal Title
Int J Geriatr Psychiatry.
Volume: -
Pages: -
DOI
Peer Reviewed
-
[Journal Article] Whole-exome sequencing and neurite outgrowth analysis in autism spectrum disorder.2016
Author(s)
Hashimoto R, Nakazawa T, Tsurusaki Y, Yasuda Y, Nagayasu K, Matsumura K, Kawashima H, Yamamori H, Fujimoto M, Ohi K, Umeda-Yano S, Fukunaga M, Fujino H, Kasai A, Hayata-Takano A, Shintani N, Takeda M, Matsumoto N, Hashimoto H.
-
Journal Title
J Hum Genet.
Volume: 61(3)
Pages: 199-206
DOI
Peer Reviewed
-
[Journal Article] Emerging roles of ARHGAP33 in intracellular trafficking of TrkB and pathophysiology of neuropsychiatric disorders.2016
Author(s)
Nakazawa T, Hashimoto R, Sakoori K, Sugaya Y, Tanimura A, Hashimotodani Y, Ohi K, Yamamori H, Yasuda Y, Umeda-Yano S, Kiyama Y, Konno K, Inoue T, Yokoyama K, Inoue T, Numata S, Ohnuma T, Iwata N, Ozaki N, Hashimoto H, Watanabe M, Manabe T, Yamamoto T, Takeda M, Kano M.
-
Journal Title
Nat Commun.
Volume: 7
Pages: 10594
DOI
Peer Reviewed
-
-
[Journal Article] Corrigendum: Emerging roles of ARHGAP33 in intracellular trafficking of TrkB and pathophysiology of neuropsychiatric disorders.2016
Author(s)
Nakazawa T, Hashimoto R, Sakoori K, Sugaya Y, Tanimura A, Hashimotodani Y, Ohi K, Yamamori H, Yasuda Y, Umeda-Yano S, Kiyama Y, Konno K, Inoue T, Yokoyama K, Inoue T, Numata S, Ohnuma T, Iwata N, Ozaki N, Hashimoto H, Watanabe M, Manabe T, Yamamoto T, Takeda M, Kano M.
-
Journal Title
Nat Commun.
Volume: 7
Pages: 11466
DOI
Peer Reviewed
-
-
[Journal Article] Functional connectivity assessed by resting state EEG correlates with cognitive decline of Alzheimer's disease - An eLORETA study.2016
Author(s)
Hata M, Kazui H, Tanaka T, Ishii R, Canuet L, Pascual-Marqui RD, Aoki Y, Ikeda S, Kanemoto H, Yoshiyama K, Iwase M, Takeda M.
-
Journal Title
Clin Neurophysiol.
Volume: 127(2)
Pages: 1269-78
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
-
-
[Journal Article] Differences of Behavioral and Psychological Symptoms of Dementia in Disease Severity in Four Major Dementias.2016
Author(s)
Kazui H, Yoshiyama K, Kanemoto H, Suzuki Y, Sato S, Hashimoto M, Ikeda M, Tanaka H, Hatada Y, Matsushita M, Nishio Y, Mori E, Tanimukai S, Komori K, Yoshida T, Shimizu H, Matsumoto T, Mori T, Kashibayashi T, Yokoyama K, Shimomura T, Kabeshita Y, Adachi H, Tanaka T.
-
Journal Title
PLoS One.
Volume: 11(8)
Pages: e0161092
DOI
Peer Reviewed
-
[Journal Article] Locomotor improvement of spinal cord-injured rats through body weight support treadmill training by plantar placement of hind paws on the floor.2016
Author(s)
Hayashibe M, Homma T, Fujimoto K, Oi T, Yagi N, Kashihara M, Nishikawa N, Ishizumi Y, Abe S, Hashimoto H, Kanekiyo K, Ide C, Morioka S.
-
Journal Title
Spinal Cord 186
Volume: 54
Pages: 521-529
Peer Reviewed
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
