多分子を同時安定高発現する遺伝子導入法の開発

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16H05401
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 宮川 周士 大阪大学, 医学系研究科, 准教授 (90273648)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 長嶋 比呂志 明治大学, 農学部, 専任教授 (50318664)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: バイオ人工膵島 / 異種移植 / 新奇遺伝子開発 / 補体制御因子 / Hybrid

Outline of Annual Research Achievements

CTDMに換わる新しいハイブリッド分子として、C1-INH + DAF(CD55) + MCP(CD46)= C1DMを作成し、次にThrombomodulinを2Aで繋いだ。さらにHLA-Ev147-2A-beta-microglobulinを繋いだ大きなプラスミッドを構築した。
またさらに、loxP-Puromycine resistant gene-loxPをその下流に繋ぎ、cre-loxP systemで後から飛ばせるようにし、CMAH遺伝子のExon7のtargetting pointの両側の１kbpほどをwingとしてつけたknockin用vectorを完成させた。
同時に、U6-promoterの下流にCMAHのexon7をknockoutするためのCRISPR vector, pX330-CMAH,を用意した。また、同じくalpha1,3Galactosyl Transferase geneのexon4をknockoutするためのCRISPR vector, pX330-alphaGal,も用意した。
加えて、昨年よりのCD200とCL-SP-D分子に関しては、そのmonocyte/macrophageに対する制御機能がそれぞれCD200RとSIRPalphaのITIMを通じ、SHP-1が介することで発揮する事を確認した。またさらに、新しくCD31をノミネートしブタの血管内皮に発現させ、この分子がmonocyte/macrophageの次に問題となる好中球の攻撃を同じ様な機構で抑制することを確認した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

一応今年度計画した分子の作成はほぼ行えた。また、alpha1,3Galactosyl TransferaseやCMAH遺伝子のknockoutの用意も完了した。
さらに、新しく組み込む分子としてのスクリーニングで、CD200やCL-SP-DやCD31の有効性を検討できた。

Strategy for Future Research Activity

実際にknockinしてみて、通常のtransfectionとの各分子の発現量差を比較検討して、ブタの作成に取り掛かる方針である。
ただ、最近の論文報告から、knockinによる各分子の発現が期待したほど十分なものとは言えず、限定的である場合が多いこともわかり出したため、この企画に加えて、多くの分子を一塊として遺伝子導入し、高発現させる準備に取り掛かる。

Research Products

• [Journal Article] A membrane-type surfactant protein D (SP-D) suppresses macrophage-mediated cytotoxicity in swine endothelial cells (2018)
  • Author(s): Jiaravuthisan Patmika、Maeda Akira、Takakura Chihiro、Wang Han-Tang、Sakai Rieko、Shabri Afifah Mohd、Lo Pei-Chi、Matsuura Rei、Kodama Tasuku、Eguchi Hiroshi、Okuyama Hiroomi、Miyagawa Shuji
  • Journal Title: Transplant Immunol Volume: - Pages: 30132～30136
  • DOI: 10.1016/j.trim.2018.02.003
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Human CD31 on porcine cells suppress xenogeneic neutrophil-mediated cytotoxicity via the inhibition of NETosis (2018)
  • Author(s): Han-Tang Wang, Akira Maeda, Rieko Sakai, Pei-Chi Lo, Chihiro Takakura, Patmika Jiaravuthisan, Afifah Mod Shabri, Rei Matsuura, Tasuku Kodama, Shohei Hiwatashi, Hiroshi Eguchi, Hiroomi Okuyama and Shuji Miyagawa
  • Journal Title: Xenotransplantation Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] REMINISCENCES OF XENOTRANSPLANTATION STUDIES (2018)
  • Author(s): Shuji Miyagawa
  • Journal Title: Reminiscences of xeno pioneers Volume: - Pages: -
• [Journal Article] The State of Xenotransplantation (2017)
  • Author(s): Shuji Miyagawa, Akira Maeda, Hiroshi Eguchi, Rieko Sakai, Pei-Chi Lo, Hantang Wang, Chihiro Takakura, Tasuku Komama, Rei Matsuura and Hiroomi Okuyama
  • Journal Title: Xenotransplantation - New Insights Volume: - Pages: 3～10
  • DOI: 10.5772/intechopen.69563
  • Open Access
• [Journal Article] Human CD200 suppresses macrophage-mediated xenogeneic cytotoxicity and phagocytosis (2017)
  • Author(s): Sakai Rieko、Maeda Akira、Choi Thuy-Vy、Lo Pei-Chi、Jiaravuthisan Patmika、Shabri Afifah Mod、Wang Han-Tang、Matsuura Rei、Kodama Tasuku、Eguchi Hiroshi、Okuyama Hiroomi、Miyagawa Shuji
  • Journal Title: Surg Today Volume: 48 Pages: 119～126
  • DOI: 10.1007/s00595-017-1546-2
  • Peer Reviewed
• [Presentation] ヒトCD31によるマクロファージ誘導異種移植拒絶反応の抑制 (2018)
  • Author(s): 高倉千裕、王瀚棠、前田晃、坂井理恵子、Lo Pei-Chi、松浦玲、児玉匡、樋渡勝平、 江口寛、奥山宏臣、宮川周士
  • Organizer: 第20回日本異種移植研究会
• [Presentation] The effect of human CD31 transfection to porcine cell in neutrophil-mediated xenogeneic rejection (2018)
  • Author(s): Han-Tang WANG, Akira MAEDA, Rieko SAKAI, Pei-Chi LO, Afifah Mohd SHABRI, Patmika JIARAVUTHISAN, Hiroshi EGUCHI,Shuji Miyagawa
  • Organizer: 第20回日本異種移植研究会
• [Presentation] PQA-18, a novel immunosuppressant, suppresses macrophage differentiation and macrophage-mediated xenogeneic cytotoxicity (2018)
  • Author(s): Pei-Chi Lo, Akira Maeda, Rieko Sakai, Chihiro Takakura, Rei Matsuura, Tasuku Kodama, Shohei Hiwatashi, Hiroshi Eguchi, Hiroomi Okuyama, Shuji Miyagawa
  • Organizer: 第20回日本異種移植研究会
• [Presentation] ブタのヒトに対する自然免疫反応および仔ブタの抗ヒト抗体獲得に関する研究 (2018)
  • Author(s): 坂井理恵子、渡邊將人、前田 晃、Lo Pei-Chi、王 瀚棠、江口 寛、井上 亮、長嶋比呂志、奥山宏臣、宮川周士
  • Organizer: 第20回日本異種移植研究会
• [Presentation] CD200-CD200R会合によるマクロファージ誘導異種移植拒絶反応の抑制 (2017)
  • Author(s): 坂井理恵子、Lo Pei-Chi、前田 晃、王 瀚棠、松浦 玲、児玉 匡、高倉千裕、江口 寛、奥山宏臣、宮川周士
  • Organizer: 第53回日本移植学会
• [Presentation] 臨床でのバイオ人工膵島移植の普及をめざして (2017)
  • Author(s): 宮川周士、前田 晃、坂井理恵子、Lo Pei-Chi、高倉千裕、松浦 玲、児玉 匡、上野豪久、後藤昌史、松本慎一、長嶋比呂志、江口 寛、奥山宏臣
  • Organizer: 第53回日本移植学会
• [Presentation] The innate immunological response of pigs against humans (2017)
  • Author(s): Rieko Sakai, Masahito Watanabe, Akira Maeda, Pei-chi Lo, Han-Tang Wang, Rei Matsuura, Tasuku Kodama, Hiroshi Eguchi, Hitomi Matsunari, Ryo Inoue, Hiroshi Nagashima, Hiroomi Okuyama, Shuji Miyagawa
  • Organizer: The 14th International Xenotransplantation Association, in Baltimore
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Suppression of macrophage-mediated cytotoxicity by a membrane-type SP-D (2017)
  • Author(s): Patmika Jiaravuthisan, Akira Maeda, Han-Tang Wang, Rieko Sakai, Afifah Mohd Shabri, Rei Matsuura, Tasuku Kodama, Hiroshi Eguchi, Hiroomi Okuyama, Shuji Miyagawa
  • Organizer: The 14th International Xenotransplantation Association, in Baltimore
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] hCD200 suppresses the M0 macrophage-mediated cytotoxicity through binding to CD200R (2017)
  • Author(s): Akira Maeda, Rieko Sakai, Pei-Chi Lo, Han-Tang Wang, Rei Matsuura, Tasuku Kodama, Hiroshi Eguchi, Hiroomi Okuyama, Shuji Miyagawa
  • Organizer: The 14th International Xenotransplantation Association, in Baltimore
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Human CD31 suppresses the neutrophil-mediated xenogeneic rejection (2017)
  • Author(s): Akira Maeda, Han-Tang Wang, Rieko Sakai, Rei Matsuura, Tasuku Kodama, Hiroshi Eguchi, Hiroomi Okuyama, Shuji Miyagawa
  • Organizer: The 14th International Xenotransplantation Association, in Baltimore
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] The membrane-type surfactant protein D may provide an effective therapeutic strategy to inhibit macrophage-mediated xenograft rejection (2017)
  • Author(s): Shuji Miyagawa, Patmika Jiaravuthisan, Akira Maeda, Han-Tang Wang, Pei-chi Lo, Rieko Sakai, Afifah Mohd Shabri, Rei Matsuura, Tasuku Kodama, Takehisa Ueno, Hiroshi Eguchi, Hiroomi Okuyama
  • Organizer: CAST 2017 in Cebu
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] The immunological response of pigs anti-human cell, included issues such as the production of natural antibodies in newborn (2017)
  • Author(s): Rieko Sakai, Masahito Watanabe, Akira Maeda, Pei-chi Lo, Han-Tang Wang, Rei Matsuura, Tasuku Kodama, Takehisa Ueno, Hiroshi Eguchi, Hitomi Matsunari, Ryo Inoue, Hiroshi Nagashima, Hiroomi Okuyama, Shuji Miyagawa
  • Organizer: CAST 2017 in Cebu
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] CD200 suppresses the M0 but not M1 macrophage mediated xenocytotoxicity (2017)
  • Author(s): Rieko Sakai, Pei-Chi Lo, Akira Maeda, Han-Tang Wang, Rei Matsuura, Tasuku Kodama, Takehisa Ueno, Chihiro Takakura, Hiroshi Eguchi, Hiroomi Okuyama, Shuji Miyagawa
  • Organizer: CAST 2017 in Cebu
  • Int'l Joint Research