2017 Fiscal Year Annual Research Report
iPS細胞由来自己細胞と脱細胞化肝臓を用いた移植可能人工肝臓作製に関する研究
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16H05489
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
安近 健太郎 京都大学, 医学研究科, 客員研究員 (00378895)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
上本 伸二 京都大学, 医学研究科, 教授 (40252449)
石井 隆道 京都大学, 再生医科学研究所, 研究員 (70456789)
福光 剣 京都大学, 医学研究科, 特定病院助教 (70700516)
河合 隆之 京都大学, 医学研究科, 医員 (00813867)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 再生医療 / 組織工学 / 肝臓移植 / ヒトiPS細胞 / 人工臓器 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
以前より我々は既にラット生体肝臓を脱細胞化して肝臓の3次元scaffoldを作製する技術を獲得していた。また、我々が既に確立した、マウス胎児肝細胞を回収し増速させて得た初代培養細胞、および成体肝細胞を脱細胞化した肝臓（3D scaffold）へ注入すると共に、再細胞化した肝臓を循環培養する実験を進めていた。まず、脱細胞化・再細胞化プロトコールの最適化を目的に再細胞化肝臓のviabilityとfunctionの評価を行い、細胞懸濁液の濃度、注入する際の至適プロトコールを調整のうえ、注入する細胞数や条件を適正化した。その過程において、従来は主流であった経門脈的再細胞化よりも経胆管的再細胞化において優位に高い生着率が得られ、かつ生着した細胞のviabilityも高いことを確認した。また、再細胞した肝臓組織に培養液を環流しながら培養する、いわゆる循環培養のプロトコールを改良してきた。これらの研究を通じて、再細胞化肝臓作製における細胞源として胎児肝細胞が有用であること、また再細胞化における細胞注入の経路は胆管が適していることを示した。これらの研究成果を基に、サイズの大きなヒト細胞の再細胞化へ向けた脱細胞化肝臓への新規細胞注入方法の有効性を検証した。
ヒトiPS細胞を分化誘導することで、iPS由来肝細胞様細胞を作製し、これを2次元培養dishより回収、3D scaffoldへ注入して循環培養することで、ヒト細胞由来、自己組織由来の人工肝臓を作製する。この肝臓は、自己組織由来であるため、拒絶反応を起こすことが無いため、移植可能な人工臓器として将来有望な治療手段となりうる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
再細胞化における投与ルートに関しては、前年度の研究成果を踏まえて、一般的に選択される経門脈的投与ではなく、当研究室が解剖学的特性を考慮して開発した経胆管的投与を用いることにより、再細胞化した細胞が有効にparechymal spaceに分布することを確認した。
ヒトiPS細胞の肝細胞分化については、かつて当研究室から京都大学iPS細胞研究センター（CiRA）の山中研究室へ出向し、共同研究により発表した分化誘導を用いている。本研究において、再細胞化に用いる肝細胞様細胞は、どの段階まで成熟化した細胞を用いるかについて検証したところ、内胚葉のマーカーを発現したばかりの未熟な細胞では、十分な肝細胞機能を発現するまで成熟化させることが出来ないことが判明した。iPS由来の肝細胞様細胞を再細胞化に用いる場合における適切な成熟度についての検証を進めている。
投与細胞の調整法については、大きな構造的障壁がなく投与可能となることが想定されることから、投与細胞をsingle cellにせず、一定の凝集塊として投与可能であるかどうかも検証したところ、胆管内腔に細胞塊が塞栓してしまい、parenchymal spaceの抹消にまで分布させることが出来なかった。一方、ヒトiPS細胞を文化誘導した肝細胞様細胞は、single cellにしてしまうと、急速にviabilityが下がり、再細胞化後の生着率や機能が十分に維持されないことも判明した。そこで、iPS由来肝細胞様細胞を2次元培養から回収する際のプロトコールを改善することで、その生着率やviabilityを改善することが出来た。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成30年度も京都大学iPS細胞研究センター（CiRA）の長船研究室の協力のもとに当研究室におけるヒトiPS細胞由来肝細胞の分化誘導法の継承・維持を継続するとともに、再細胞化に適した分化段階の特定や、2次元培養から細胞を回収する際の細胞障害を軽減させるプロトコール改良を引き続き進める。
また、再細胞化した肝臓に門脈から培養液を循環させる培養法についても改良を試みる。これまで当研究室にて行ってきた方法は主にラットの初代培養細胞やヒト細胞株を用いてきたが、ヒトiPS由来の肝細胞様細胞については、培養液の還流によるシェアストレスにより著しく培養細胞のviabilityが下がることが分かった。そこで循環培養についても、その詳細に関して改良を進めていく。
さらに、当研究室より、ラット肝臓の研究において類類洞内皮細胞（LSEC）を経門脈的に再細胞化することで、parenchymal spaceに肝実質細胞と類洞上皮細胞を再細胞化することで、より生理的な臓器形成を目指した実験も行った結果、類洞内皮がその特徴を維持するだけでなく、肝細胞の機能も維持することが示された。また、血液還流をすると、血栓形成も抑制されるため、生体に移植する際の技術的な進歩をラットにおいて示すことができた。その研究結果を踏まえて、本研究においてもLSECを門脈より再細胞化することで、ヒトiPS由来肝細胞様細胞の機能を維持しつつ、将来の移植可能な肝臓作製への道筋をつける。
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Research Products
(16 results)
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[Journal Article] Establishment of practical recellularized liver graft for blood perfusion using primary rat hepatocytes and liver sinusoidal endothelial cells2018
Author(s)
Kojima H, Yasuchika K, Fukumitsu K, Ishii T, Ogiso S, Miyauchi Y, Yamaoka R, Kawai T, Katayama H, Yoshitoshi-Uebayashi EY, Kita S, Yasuda K, Sasaki N, Komori J, Uemoto S.
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Journal Title
Am J Transplant.
Volume: 18
Pages: 1351-1359
DOI
Peer Reviewed
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[Presentation] A novel culture system preserving natural scaffolds of fibrotic livers accelerates progression of hepatocellular carcinoma cells2018
Author(s)
Yuya Miyauchi, Kentaro Yasuchika Yu Oshima, Hiroshi Kawamoto, Takahito Minami, Hidenobu Kojima, Ryoya Yamaoka, Takayuki Kawai, Satoshi Ogiso, Ken Fukumitsu, Takamichi Ishii, Shinji Uemoto
Organizer
The Asian Pacific Association for the Study of the Liver Single topic Conference on HCC
Invited
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[Presentation] A novel three-dimensional culture system, decellularized-tissue obtained from cirrhotic livers, enhances an epithelial-mesenchymal transition phenotype in HCC cells2017
Author(s)
Yuya Miyauchi, Kentaro Yasuchika, Ken Fukumitsu, Satoshi Ogiso, Hidenobu Kojima, Ryoya Yamaoka, Takayuki Kawai, Hokahiro Katayama, Elena Y Yoshitoshi, Sadahiko Kita, Katsutaro Yasuda, Naoya Sasaki, Takamichi Ishii, Junji Komori, Shinji Uemoto
Organizer
American college of Surgeons clinical congress
Invited
