Determination of anti-osteoclastgenesis sites of lactoferrin and development of peptide therapeutics for bone destructive diseases

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16H05503
• Research Institution: Hiroshima University
• Principal Investigator: 高田 隆 広島大学, 医歯薬保健学研究院(歯), 教授 (10154783)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 楯 真一 広島大学, 理学研究科, 教授 (20216998) ; 栃尾 尚哉 広島大学, 理学研究科, 特任准教授 (70466035) ; 宮内 睦美 広島大学, 医歯薬保健学研究院(歯), 准教授 (50169265) ; 古庄 寿子 広島大学, 医歯薬保健学研究院(歯), 助教 (00634461) ; 安藤 俊範 広島大学, 医歯薬保健学研究院(歯), 助教 (40754552)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: ラクトフェリン / 骨破壊疾患 / 関節リウマチ / 歯周病 / 破骨細胞 / ペプチド医薬 / TRAF-6 / TNF-α

Outline of Annual Research Achievements

本研究では核磁気共鳴法を用いた TRAF6-LF 相互作用解析により、ラクトフェリン（LF）の破骨細胞形成抑制部位を決定し、その合成ペプチドの抗炎症作用や破骨細胞形成阻害作用を検討することによって、同合成ペプチドが骨破壊性病変に対する有効なペプチド医薬になるかどうか明らかにするため、以下の検討を行った。
１．LF の TRAF6 結合部位の決定:LFのプロテアーゼ限定分解産物からTRAF6に結合するフラグメントをpull-down法により単離した。プロテアーゼにより分解されたLFフラグメントからTRAF6に結合する異なるフラグメントの配列を質量分析により決定した。各フラグメントの配列解析の結果から、共通する配列をLF結合部位として同定した（LFペプチド１、LFペプチド２）。
２．LFとTRAF6との相互作用の解析:TRAF6-LFの相互作用解析を，等温滴定型熱量計（ITC）を用いて行った結果、LFはTRAF6と結合することで、TRAF6のユビキチン化を阻害するという機構が考えられた。
３．LFのTRAF6 結合部位に相当するペプチド合成とその機能解析 :LF ペプチド１とLFペプチド２を化学合成し、それらの破骨細胞形成促進因子産生に対する影響を解析した。その結果、LFペプチド２がLPS刺激下で骨芽細胞やマクロファージの産生するサイトカインの発現やそのシグナル伝達を抑制することが明らかになった。
以上の結果から、LFペプチドを骨破壊性病変に対するペプチド医薬として用いるための次年度以降の検討の基盤を形成できた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

破骨細胞形成に関わるサイトカイン産生を阻害するラクトフェリンの活性部位を同定し、その部の合成ペプチドが破骨細胞形成を抑制することが明らかとなった。当初予定していた研究が概ね順調に進行していると考える。この結果を受けて来年度はin vivoの検討を計画書に沿って実施する。

Strategy for Future Research Activity

破骨細胞形成に関わるサイトカイン産生を阻害するラクトフェリンの活性部位を同定し、その部の合成ペプチドが破骨細胞形成を抑制することが明らかとなった。当初予定していた研究が概ね順調に進行していると考える。この結果を受けて来年度はin vivoの検討を計画書に沿って実施する。なお、in vivoの検討にあたっては、歯周病モデルや関節リウマチモデルに先立って、より簡易な炎症モデルで同定したペプチドの抗炎症作用についても検討したい。