2016 Fiscal Year Annual Research Report
Development of iPS cell-based tooth regeneration techniques by a transposon-based gene delivery system
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16H05519
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
江草 宏 東北大学, 歯学研究科, 教授 (30379078)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
新部 邦透 東北大学, 大学病院, 助教 (50468500)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 再生歯学 / iPS細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、iPS 細胞から歯胚再生を誘導する戦略として、上皮間葉相互作用という三次元的な発生環境の模倣（空間的模倣）に加えて、歯胚発生のキーとなる遺伝子を本来の発生過程で発現している時期を模倣して誘導するアプローチ（時間的模倣）を提案する。これを実現するため、トランスポゾンを利用した遺伝子導入法から導入遺伝子の発現のOn/Off を自在に制御する技術を応用する。本研究の目的は、歯胚発生のキーとなる遺伝子の発現が調節可能なiPS 細胞を作製し、発生過程の時間・空間的な模倣による歯胚誘導を試みることによって、iPS 細胞を用いた歯の再生技術の基盤を確立することである。
初年度は、初めに、歯胚の発生に関与する遺伝子BMP-4のcDNAを緑色発色PiggyBacベクターに、AmelogeninのcDNAを赤色発色PiggyBacベクターに組み込み、このベクターをTransposase発現ベクターと共にHEK293細胞に導入し、テトラサイクリン（Tet）制御性-On/Off発現誘導システムが作動することを確認した。次に、構築したPiggyBacベクターを、エレクトロポレーション法を用いてマウス歯肉由来iPS細胞株に導入し、薬剤選択クローニングを行い、適切にベクターが導入されたiPS細胞株を樹立した。樹立されたiPS細胞株においてTet制御性-On/Off発現誘導システムが作動することをリアルタイムRT-PCRおよびWestern blotting解析により確認した。また、作製した各iPS細胞株を浮遊培養によって細胞凝集塊（胚様体）を形成させ、培地にTet（ドキシサイクリン）を添加して培養した結果、導入遺伝子に加えて歯原性細胞特異的な遺伝子の発現が上昇する予備実験データを得ている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究計画の申請書には、平成28年度までに歯胚の発生に関与する遺伝子をiPS細胞に導入し、Tet制御性-On/Off発現誘導システムを確立することを計画していた。これについては、発現誘導システムの作動が確認できるiPS細胞株の樹立に成功しており、次の研究段階に進むことが可能な状況にあるため、本研究は順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
前年度までに作製したTet誘導性BMP-4あるいはAmelogenin発現制御iPS細胞株を浮遊培養によって細胞凝集塊（胚様体）を形成させ、培地にTet（ドキシサイクリン）を添加することで導入遺伝子の発現を誘導する。その結果、胚様体が歯原性上皮あるいは間葉細胞に分化が誘導されるか否かをRT-PCR、Western blotting解析および免疫蛍光観察により確認する。また、これらiPS細胞株を用いて、ドキシサイクリンを添加する時期を変化させ、導入遺伝子の発現誘導時期において最も歯原性細胞への分化を促進する時間的条件を決定する（担当：研究代表者・江草）。さらに、決定した時間的条件によってiPS細胞から分化誘導した歯原性上皮細胞および歯原性間葉細胞の細胞塊を用いて上皮間葉相互作用の誘発を試みる。このようにして構築した再生歯胚の成長（象牙質，エナメル質，歯周組織の形成）を，マウスあるいはラット腎臓被膜下への歯胚移植法を用いて観察する（担当：研究分担者・新部）。
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