2016 Fiscal Year Annual Research Report
過酷な培養環境に応答した細胞由来因子群による骨再生法
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16H05540
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
日比 英晴 名古屋大学, 医学系研究科, 教授 (90345885)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
黒田 健介 名古屋大学, 未来材料・システム研究所, 准教授 (00283408)
片桐 渉 名古屋大学, 医学系研究科, 講師 (10437030)
土屋 周平 名古屋大学, 医学部附属病院, 助教 (20569785)
興戸 正純 名古屋大学, 未来材料・システム研究所, 教授 (50126843)
山本 朗仁 名古屋大学, 医学系研究科, 准教授 (50244083)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 移植・再生医療 / 再生医学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の全体構想は過酷な環境下で幹細胞を培養し，その上清中因子群を適用することにより，大量の骨再生を可能にし，顎骨区域欠損の再建を，さらにその製剤化も目指すことであった．そしてその目的は細胞が環境に反応して自己生存に有利な因子群を放出することを利用して，組織欠損部の環境を調整し，組織を再生させるのに最適な細胞由来因子群を得るための培養条件と，生体内で実際に組織再生を誘導するのに最適な投与方法を求めることであった．
本年度は幹細胞培養上清の調製条件の探索を中心に進めた．幹細胞培養上清は，所定の手続きを経て得たヒト細胞を培養して調製した．細胞種は骨髄間葉系幹細胞，歯髄幹細胞とした．培養条件は酸素分圧，栄養，pH，機械的ストレスについて，生体にとって過酷な環境，組織破壊が起きる環境を想定して設定した．培養終了後，無血清培地でさらに48時間培養し，それを遠心分離することによりその上清を得た．培養上清の組成を明らかにするために，その中に含まれるタンパク質をマススペクトロメトリーにより網羅的に解析して同定し，その機能面からさらに種類を絞ってELISAで発現を確認し定量した．またその遺伝子発現について，培養終了後の細胞からRNAを抽出しリアルタイムRT-PCRにて解析した．培養細胞の種類，分化度と前述の培養条件を変数とし，求めるものをM1とM2の各マクロファージ，骨と血管を中心に組織再生に関連するタンパク質発現，遺伝子発現，細胞増殖能，細胞遊走能，動員される細胞の種類と動態，再生組織の範囲と密度としてin vivoで解析を進め，in vitroでは細胞増殖および遊走アッセイ，RT-PCR，ウェスタンブロッティング，管腔形成アッセイにより，組織再生に最適な因子群を含む培養上清を得るための条件を明らかにした．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は幹細胞培養上清の調製条件についてあらためて検討した．幹細胞培養上清の調製とその機能解析の手法はそれを扱ったわれわれの既報に準じた．機能解析もその既報で示したデータを活かし，それを補完できるように項目を設定したため効率的に研究を進めることができた．
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| Strategy for Future Research Activity |
マウスあるいはラットの頭蓋骨欠損モデルに培養上清を含む担体を適用して，形成された組織を組織学的，Ｘ線学的に，また多重免疫組織化学法にて評価する．細胞動態は，体外で蛍光標識した細胞を体内に導入し，組織再生の場に遊走する様相をインビボイメージングシステムにより評価する．さらに再生組織における血管網構築について血流画像解析装置で評価する．
上清中因子群の局所投与法について検討する．徐放性担体による静的投与法では培養上清の担体としてコラーゲン，リン酸カルシウムなどの許認可材料のほか，プラズマにより表面加工処理を施したチタンを用いる．培養上清中の因子や基質のチタン表面への親和性を高めることを目的とした共同研究を学内の工学博士らと進めてきており，これによりインプラント周囲に著しい骨化促進効果を示す結果が得られている．この表面処理法をチタンプレートおよびメッシュに施すことで，また上記の材料と組み合わせることで，これらが顎骨区域欠損部でも骨形成を期待し得る再建材料となる可能性がある．
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