2016 Fiscal Year Annual Research Report
歯周炎患者口腔細菌叢－腸内細菌叢連関を基盤とした全身疾患リスク因子の同定
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16H05554
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| Research Institution | Niigata University |
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Principal Investigator |
中島 貴子 新潟大学, 医歯学系, 講師 (40303143)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山崎 和久 新潟大学, 医歯学系, 教授 (00182478)
森田 英利 岡山大学, 環境生命科学研究科, 教授 (70257294)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 歯周病 / 腸内細菌 / マイクロバイオーム / メタゲノム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
腸内細菌叢の変化がメタボリックシンドローム関連疾患のリスクを高めることが報告されているが、それらの疾患は歯周疾患が関連する疾患と共通している。本研究では、歯周病原細菌によって誘導される腸内細菌の変動と、付随する腸管透過性の亢進による内毒素血症が、歯周病と糖尿病、動脈硬化性疾患などの全身疾患との関連メカニズムであるという仮説のヒトでの証明を目指す。主要目的は、ヒト歯周炎患者における口腔内細菌叢と腸内細菌叢を網羅的に解析し、健康対照者と、また、患者の歯周治療後と比較することである。第二の目的は、口腔内から飲み込んだ歯周病原細菌が腸内環境に及ぼす影響を詳細に検討するために、ヒト歯周炎患者口腔内細菌を無菌マウスに投与し腸管内に定着するかを確認することである。
これまでにヒト歯周炎患者と健常者10名程度ずつを被験者としてリクルートし、唾液と糞便試料の16S rRNA遺伝子メタゲノム解析を行った。歯周炎患者の口腔細菌叢と腸内細菌叢はユニフラック解析で求めた距離行列に基づく主座標分析(PCA)結果から、いずれも健常者とは異なっていることが明らかとなってきた。さらに、ヒト歯周炎患者の歯周治療後には、唾液細菌叢および腸内細菌叢のいずれも健常者群との差異が消失するという結果を得ている。中間データを学会発表するために準備中である。今後はデータの信頼性を高めるために被験者数を増やし解析を進める。
また、無菌マウス腸管内へのヒト歯周病原細菌の定着実験に着手した。得られた試料を分析中であり、その結果を踏まえて実験系を改変していく予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
１．ヒト歯周炎患者の治療前後の腸内および口腔内細菌叢の解析
新潟大学医歯学総合病院歯科外来を受診し、中等度以上の慢性あるいは侵襲性歯周炎と診断された患者12名を患者群として、ならびに、歯周炎を有さず全身的に健康な者10名を健常者群として、被験者をリクルートした。歯周治療開始前の患者と健常者から、糞便、唾液の採取を行った。患者群のうち10名は歯周基本治療が終了した時点で再度糞便と唾液の採取を行った。糞便と唾液サンプルは岡山大学にてDNA抽出ならびに次世代シークエンサーによる16S rRNA遺伝子のメタゲノム解析を行った。得られたデータを東京大学にて解析し、菌種数の推定、細菌叢全体構造の比較、菌種組成の推定を行った。中間データを学会発表するために準備している。
2. ヒト口腔内細菌のマウス腸管への定着実験
歯周病原細菌Porphyoromonas gingivalisをGerm Freeマウスに投与し、5週間飼育後に糞便、腸管、肝臓と血液試料を採取した。なお、当初は本実験のためのビニールアイソレーター等の購入および連携研究者の所属する理化学研究所への大学院生の派遣を予定していたが、外部業者にマウスへの細菌の投与とアイソレーター内での飼育を委託し、飼育終了時にマウスを新潟大学へ搬入した。そのため当初の予算配分よりも委託費用が増額となった。
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| Strategy for Future Research Activity |
1.ヒト歯周炎患者の治療前後の腸内および口腔内細菌叢の解析
引き続き被験者数を増やして解析を進める。中等度以上の慢性あるいは侵襲性歯周炎と診断された患者、ならびに歯周炎を有さず全身的に健康な者を被験者とする。患者のリクルートは新潟大学医歯学総合病院歯科外来に加えて、本研究の協力歯科医院でも実施し、順調に被験者数を増やすようにする。唾液細菌叢と腸内細菌叢の16S rRNAメタゲノム解析による菌叢解析の結果を踏まえて、ショットガンシークエンス解析による代謝系の解析の必要性を見極め、実施計画を作成する。歯周炎患者群の血液試料中の炎症マーカー（高感度CRP、IL-6）と内毒素レベルの測定と、歯肉縁下プラーク試料中の主要歯周病原細菌の定量解析も進め、細菌叢データと合わせてデータ解析をしていく。
2.ヒト口腔細菌のマウス腸管への定着実験
歯周病原細菌Porphyoromonas gingivalisをGerm Freeマウスに投与し、5週間飼育後に糞便、腸管、肝臓と血液を採取した。それら採取試料の解析作業を進める。腸管内への歯周病原細菌の定着を16S rRNAに対するユニバーサルプライマーを用いたPCRにて確認する。腸管透過性関連分子の発現、血中の炎症マーカーおよび内毒素レベル、肝臓の脂肪変性の解析等を行う。この解析データを踏まえて細菌の種類、数や飼育期間等について実験系の改変を行い、追加実験を実施する。
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