核内構造体によるDNA二重鎖切断修復制御機構の解明

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16H05888
• Research Institution: Ritsumeikan University
• Principal Investigator: 西 良太郎 立命館大学, 生命科学部, 助教 (80446525)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: DNA二重鎖切断 / ユビキチン化 / 核内構造体

Outline of Annual Research Achievements

DNA二重鎖切断（DNA double-strand breaks: DSBs）を適切な修復経路により修復することはゲノム恒常性を維持する上で不可欠である。現在までに、DSB修復の分子機構はこれに関与するタンパク質の同定に始まり、エピジェネテックな制御を含むクロマチンレベルにおける制御が解明されてきた。一方、ゲノムDNAは核内においてPML body等の核内構造体と混在しており、これらの核内構造体がDSB修復及び、応答に果たす役割には解明すべき点が多く残されている。本研究ではnuclear speckleの新規構成因子として見出した脱ユビキチン化酵素USP42の機能解析により、nuclear speckleがDSB修復及び、DSB依存的な転写抑制に果たす役割の解明を目的とする。
本年はUSP42のDSB修復及び、応答における機能解析を行った。USP42が機能する修復経路の同定を特異的なアッセイを用いることにより相同組換え修復(homologous recombination: HR)であることを明らかにした。さらに、USP42のノックダウンはHRの初期反応であるDNA end-resectionに遅延をもたらした。また、USP42はHR因子であるMRN複合体(MRE11-RAD50-NBS1)と複数のドメインにおいて相互作用することを見出した。これらに加えて、USP42の発現は転写レベルで細胞周期依存的に制御され、S期後期からG2期にかけてピークを示すことを明らかにした。
これらの結果から、USP42が新たなHR促進因子であることが示唆され、核内の局所に位置するゲノム領域がHRにより優先的に修復される機構が示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年はUSP42のDSB修復及び、応答における機能解析を重点的に行う予定であった。その観点からはUSP42の機能するDSB修復経路の同定、その経路における分子機構の解析を行う為の相互作用因子の同定、及び他のHR因子と同様の細胞周期依存的な発現制御の存在を明らかにすることが出来た。これらの結果から、USP42が新たなHR促進因子であることが示唆され、核内の局所に位置するゲノム領域がHRにより優先的に修復される機構が示唆された。一方、USP42のドメイン解析に関しては想定よりも詳細な解析が必要であることが明らかになった。

Strategy for Future Research Activity

今後、USP42のドメイン解析を詳細に進める。これに加えて、発展的な研究であるnuclear speckleのDSB修復への影響を検討するために、nuclear speckle因子をsmall interference RNAによりノックダウンし、HRを特異的に検出するアッセイにより、新規のHR制御機構の存在を検証する予定である。

Research Products

• [Int'l Joint Research] Gurdon Institute/University of Cambridge(英国)
  • Country Name: UNITED KINGDOM
  • Counterpart Institution: Gurdon Institute/University of Cambridge
• [Journal Article] Thymine DNA glycosylase modulates the DNA damage response and gene expression by base excision repair-dependent and -independent mechanisms (2017)
  • Author(s): Tomohumi Nakamura, Kouichi Murakami, Haruto Tada, Yoshihiko Uehara, Jumpei Nogami, Kazumitsu Maehara, Yasuyuki Ohkawa, Hisato Saitoh, Hideo Nishitani, Tetsuya Ono, Ryotaro Nishi, Masayuki Yokoi, Wataru Sakai, and Kaoru Sugasawa
  • Journal Title: Genes to Cells Volume: 22 Pages: 392-405
  • DOI: 10.1111/gtc.12481
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] BRCA1 directs the repair pathway to homologous recombination by promoting 53BP1 dephosphorylation (2017)
  • Author(s): Mayu Isono, Atsuko Niimi, Takahiro Oike, Yoshihiko Hagiwara, Hiro Sato, Ryota Sekine, Yukari Yoshida, Shin-Ya Isobe, Chikashi Obuse, Ryotaro Nishi, Elena Petricci, Shinichiro Nakada, Takashi Nakano and Atsushi Shibata
  • Journal Title: Cell Reports Volume: 18 Pages: 520-532
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2016.12.042.
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] DNA二本鎖切断応答における脱ユビキチン化酵素UCHL3の翻訳後修飾解析 (2016)
  • Author(s): 木村祐輔、松井美咲、堀利行、Stephen P Jackson、西良太郎
  • Organizer: 第39回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川県、横浜市）
  • Year and Date: 2016-12-01 – 2016-12-01
• [Presentation] DNA二本鎖切断応答におけるUSP42の機能解析 (2016)
  • Author(s): 松井美咲、木村祐輔、堀利行、Stephen P Jackson、西良太郎
  • Organizer: 第39回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川県、横浜市）
  • Year and Date: 2016-12-01 – 2016-12-01
• [Presentation] 相同組換え修復における脱ユビキチン化酵素USP42の機能解析 (2016)
  • Author(s): 松井美咲、木村祐輔、堀利行、Stephen P Jackson、西良太郎
  • Organizer: 日本放射線影響学会第59回大会
  • Place of Presentation: JMSアステールプラザ（広島県、広島市）
  • Year and Date: 2016-10-27 – 2016-10-27
• [Presentation] 脱ユビキチン化酵素UCHL3の翻訳後修飾のDSB応答における機能解析 (2016)
  • Author(s): 木村祐輔、松井美咲、堀利行、Stephen P Jackson、西良太郎
  • Organizer: 日本放射線影響学会第59回大会
  • Place of Presentation: JMSアステールプラザ（広島県、広島市）
  • Year and Date: 2016-10-26 – 2016-10-28
• [Presentation] UCH脱ユビキチン化酵素ファミリーによって制御されるDNA二重鎖切断修復機構 (2016)
  • Author(s): Ryotaro Nishi, Yusuke Kimura, Misaki Matsui and Stephen P Jackson
  • Organizer: 日本放射線影響学会第59回大会
  • Place of Presentation: JMSアステールプラザ（広島県、広島市）
  • Year and Date: 2016-10-26 – 2016-10-26
  • Invited
• [Presentation] Post-translational modification of UCHL3 in response to DNA double-strand break (2016)
  • Author(s): Yusuke Kimura, Misaki Matsui, Stephen P Jackson Ryotaro Nishi
  • Organizer: The 32rd RBC International Symposium “Growing Edge of Radiation Biology, from principles to applications
  • Place of Presentation: Coop-Inn Kyoto（京都府、京都市）
  • Year and Date: 2016-09-02 – 2016-09-02
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Functional analysis of USP42 in DNA double-strand break responses (2016)
  • Author(s): Misaki Matsui, Yusuke Kimura, Stephen P Jackson, Ryotaro Nishi
  • Organizer: The 32rd RBC International Symposium “Growing Edge of Radiation Biology, from principles to applications
  • Place of Presentation: Coop-Inn Kyoto（京都府、京都市）
  • Year and Date: 2016-09-02 – 2016-09-02
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] DNA double-strand break repair and responses regulated by UCH family deubiquitylating enzymes (2016)
  • Author(s): Ryotaro Nishi
  • Organizer: The 32rd RBC International Symposium “Growing Edge of Radiation Biology, from principles to applications
  • Place of Presentation: Coop-Inn Kyoto（京都府、京都市）
  • Year and Date: 2016-09-01 – 2016-09-01
  • Int'l Joint Research / Invited