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2018 Fiscal Year Annual Research Report

膜タンパク質における修飾糖鎖の機能解明を目指した細胞表面糖鎖ネットワークの解析

Research Project

Project/Area Number 16H05924
Research InstitutionOsaka University

Principal Investigator

真鍋 良幸  大阪大学, 理学研究科, 助教 (00632093)

Project Period (FY) 2016-04-01 – 2020-03-31
Keywords糖鎖 / 糖鎖合成 / レクチン / イメージング
Outline of Annual Research Achievements

本研究では,膜タンパク質上のN結合型糖鎖(N-グリカン)が形成する相互作用ネットワークを解析し,N-グリカンが膜タンパク質の機能調節を行う分子基盤を解明する.まず,申請者がこれまでに確立した合成技術を活用して,N-グリカンの合成ライブラリを構築する.これをプローブとして用い,それぞれの糖鎖構造が膜タンパク質の動態に与える影響を明らかにするとともに,その動態変化を引き起こす相互作用分子を同定する.さらに,レクチン(糖鎖認識タンパク質)によるN-グリカン認識の構造基盤を解明する.
コアフコース,バイセクティンググルコサミン,ポリラクトサミン,末端ガラクトースおよび末端シアル酸の機能を調べるために,糖鎖ライブラリを合成した.昨年度までにコアフコース含有糖鎖およびバイセクティンググルコサミン含有糖鎖の合成を達成した.また,ポリラクトサミン含有糖鎖の化学酵素合成に行い,鎖長の異なる複数の糖鎖の合成も達成した.年度はN-グリカンの網羅的な合成を実現するために,多様性指向型の合成ルートを探索した.
GPIアンカータンパク質およびトランスフェリン受容体にHaloTagを融合したタンパク質をHeLa細胞に発現させた.HaloTagは,ハロゲン化アルキル(HaloTagリガンド)と低濃度で速やかに反応し,共有結合を形成する.ここではHalo Tagリガンドとして合成糖鎖を作用させ,純粋な合成糖鎖で標識したモデル膜タンパク質を調製する.昨年度までに糖鎖と蛍光基を導入したHaloTagリガンドを調製しており,これを細胞表面に提示できることをと示し,さらに,この手法で提示した糖鎖がレクチンに認識されることを示した.今後,この擬糖鎖修飾膜タンパク質の蛍光観察により,糖鎖修飾がエンドサイトーシスや膜上での拡散など膜タンパク質の動態に及ぼす影響を調べる.

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究の肝は,N-グリカンの合成である.機能解明には,均一構造のN-グリカンを用いることが必須で,そのために化学合成を検討している.これまでに,N-グリカンの大量合成を指向し,さまざまな検討を行ってきた.精密条件下でのスケールアップが可能なマイクロフロー反応を有効に利用し,中間体となるフラグメント(2-4糖構造)を10 g以上のスケールで合成した.また,グリコシル化反応でのエーテル溶媒による反応中間体の安定化や,アミド(‐NHAc)のイミド(‐NAc2)保護による反応性向上の効果を見出した.巨大な糖鎖同士のグリコシル化において保護基のパターンを最適化することで,収率,立体選択性が劇的に向上することも示した.これにより重要な機能を持つコアフコース含有12糖とバイセクティンググルコサミン含有8糖の合成を達成した.またこの過程で,汎用性の高い合成ルートを採用しているため,多くのN-グリカンにこの合成法は適用可能である.実際,ここで確立した手法を用いて糖鎖骨格を構築し,その骨格に対して,酵素を用いた糖鎖伸張を行うことで,ポリラクトサミン鎖を含有する糖鎖の合成に成功した.
膜タンパク質の機能解明においては,HaloTagを用いた蛍光イメージングを行う予定である.すでにHaloTag発現細胞を調製し,合成糖鎖の提示に成功している.加えてこの合成糖鎖がレクチンに認識されることも確認している.現在,一分子蛍光観察を含めた種々の蛍光観察により詳細な動態評価に着手している.
加えて,糖鎖とレクチンの相互作用を原子レベルで解析するためにSTD-NMRを用いた実験を行う予定であるが,これに関してもすでに実験を始めており,この系が機能することを確認している.また,コアフコースを認識する新たなレクチンの探索も行っており,その候補となるタンパク質を突き止めるに至った.今後詳細な解析を行う予定である.

Strategy for Future Research Activity

i) N-グリカンライブラリの構築:N-グリカンライブラリを合成する.これまでに確立した合成法を改良し,ポリラクトサミン鎖やシアル酸を含有する多分枝糖鎖を合成する.ポリラクトサミン含有糖鎖に関しては,糖鎖骨格を化学合成により構築し,酵素反応を用いてポリラクトサミン鎖を構築する.シアル酸含有糖鎖に関しては,我々がこれまでに開発してきたシアリル化反応を用いてシアル酸含有糖鎖を構築し,これを還元末端の糖鎖フラグメントに結合させる.ポリラクトサミン含有糖鎖はガレクチンとの,シアル酸含有糖鎖はシグレックとの相互作用を詳細に調べるために必須である.これらの糖鎖を効率的に合成するために,多様性指向型の合成ルートを検討しており,その確立を急ぐ.
ii) 糖鎖修飾膜タンパク質の動態解析と相互作用分子の同定:これまでに構築したHaloTagのシステムを用いて合成糖鎖を導入した膜タンパク質の動態解析を行う.これまでに,ポリラクトサミンやコアフコースがエンドサイトーシスを抑え,バイセクティンググルコサミンがエンドサイトーシスを促進することを示唆する結果が報告されているが,何れも生化学的実験からの間接的なデータである.そこで,合成した全ての糖鎖の挙動をイメージングし,この現象を明確に示す.特にガレクチンとシグレックが関与すると考えられる糖鎖に関してはこれらのレクチンを投与することでこの現象を明確に示す.
iii) 糖鎖‐レクチンの相互作用解析:ヒトが持つ10種類のガレクチンおよび11種類のシグレックのうち,まず,ガレクチン-1,3とシグレック-2に焦点を当て,糖鎖との親和性を調べる.シグレックに関しては市販されておらず,膜貫通部分を除いた糖鎖認識部位のみを発現させて用いる.まず,SPRにより糖鎖とレクチンの親和性を調べる.さらに,レクチンと強く相互作用した糖鎖はSTD-NMRによりレクチンの認識部位を明らかにする.

  • Research Products

    (27 results)

All 2019 2018 Other

All Int'l Joint Research (2 results) Journal Article (8 results) (of which Int'l Joint Research: 5 results,  Peer Reviewed: 8 results,  Open Access: 1 results) Presentation (17 results) (of which Int'l Joint Research: 9 results,  Invited: 1 results)

  • [Int'l Joint Research] Academia Sinica/精華大学(中国)

    • Country Name
      CHINA
    • Counterpart Institution
      Academia Sinica/精華大学
  • [Int'l Joint Research] University of Napoli Federico II(イタリア)

    • Country Name
      ITALY
    • Counterpart Institution
      University of Napoli Federico II
  • [Journal Article] Development of α-Gal-Antibody Conjugates to Increase Immune Response by Recruiting Natural Antibodies2019

    • Author(s)
      Sianturi Julinton、Manabe Yoshiyuki、Li Hao-Sheng、Chiu Li-Ting、Chang Tsung-Che、Tokunaga Kento、Kabayama Kazuya、Tanemura Masahiro、Takamatsu Shinji、Miyoshi Eiji、Hung Shang-Cheng、Fukase Koichi
    • Journal Title

      Angewandte Chemie International Edition

      Volume: 58 Pages: 4526~4530

    • DOI

      10.1002/anie.201812914

    • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Kinetically Controlled Fischer Glycosidation under Flow Conditions: A New Method for Preparing Furanosides2019

    • Author(s)
      Fukase Koichi、Masui Seiji、Manabe Yoshiyuki、Hirao Kohtaro、Shimoyama Atsushi、Fukuyama Takahide、Ryu Ilhyong
    • Journal Title

      Synlett

      Volume: 30 Pages: 397~400

    • DOI

      10.1055/s-0037-1611643

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Synthesis And Immunological Evaluation of Self-adjuvanting Anticancer Vaccine Candidate.2019

    • Author(s)
      Manabe, Y., Chang, T-C., Feng, Q., Fujimoto, Y., Ohshima, S., Kametani, Y., Kabayama, K., Nimura, Y., Lin, C-C., Fukase, K.
    • Journal Title

      Peptide Science

      Volume: 2019 Pages: in press

    • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Single-Step Per-O-Sulfonation of Sugar Oligomers with Concomitant 1,6-Anhydro Bridge Formation for Binding Fibroblast Growth Factors2018

    • Author(s)
      Yeh Che-Jui、Ku Chiao-Chu、Lin Wei-Chen、Fan Chiao-Yuan、Zulueta Medel Manuel L.、Manabe Yoshiyuki、Fukase Koichi、Li Yaw-Kuen、Hung Shang-Cheng
    • Journal Title

      ChemBioChem

      Volume: 20 Pages: 237~240

    • DOI

      10.1002/cbic.201800464

    • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Branched Sialylated N-glycans Are Accumulated in Brain Synaptosomes and Interact with Siglec-H2018

    • Author(s)
      Handa-Narumi Mai、Yoshimura Takeshi、Konishi Hiroyuki、Fukata Yuko、Manabe Yoshiyuki、Tanaka Katsunori、Bao Guang-ming、Kiyama Hiroshi、Fukase Koichi、Ikenaka Kazuhiro
    • Journal Title

      Cell Structure and Function

      Volume: 43 Pages: 141~152

    • DOI

      10.1247/csf.18009

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Convergent Synthesis of a Bisecting N-Acetylglucosamine (GlcNAc)-Containing N-Glycan2018

    • Author(s)
      Manabe Yoshiyuki、Shomura Hiroki、Minamoto Naoya、Nagasaki Masahiro、Takakura Yohei、Tanaka Katsunori、Silipo Alba、Molinaro Antonio、Fukase Koichi
    • Journal Title

      Chemistry - An Asian Journal

      Volume: 13 Pages: 1544~1551

    • DOI

      10.1002/asia.201800367

    • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Syntheses and Immunological Evaluation of Self-Adjuvanting Clustered N-Acetyl and N-Propionyl Sialyl-Tn Combined with a T-helper Cell Epitope as Antitumor Vaccine Candidates2018

    • Author(s)
      Chang Tsung-Che、Manabe Yoshiyuki、Fujimoto Yukari、Ohshima Shino、Kametani Yoshie、Kabayama Kazuya、Nimura Yuka、Lin Chun-Cheng、Fukase Koichi
    • Journal Title

      Angewandte Chemie International Edition

      Volume: 57 Pages: 8219~8224

    • DOI

      10.1002/anie.201804437

    • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Narrower HOMO-LUMO gap attained by conformational switching through peripheral polyarylation in 1,4,5,8-tetraaza-9,10-anthraquinodimethanes2018

    • Author(s)
      Suzuki Takanori、Ishigaki Yusuke、Sugawara Kazuma、Umezawa Yu、Katoono Ryo、Shimoyama Atsushi、Manabe Yoshiyuki、Fukase Koichi、Fukushima Takanori
    • Journal Title

      Tetrahedron

      Volume: 74 Pages: 2239~2244

    • DOI

      10.1016/j.tet.2018.03.041

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] Synthesis and function study of glycoconjugate vaccine for efficient cancer2019

    • Author(s)
      Yoshiyuki Manabe
    • Organizer
      日本化学会 第99春季年会 (2019)
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] Synthesis and immunological evaluation of self-adjuvanting anticancer vaccine candidate2018

    • Author(s)
      Yoshiyuki Manabe, Tsung-Che Chang, Qi Feng, Yukari Fujimoto, Shino Ohshima, Yoshie Kametani, Kazuya Kabayama, Yuka Nimura, Chun-Cheng Lin, Koichi Fukase
    • Organizer
      10th International Peptide Symposium
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Syntheses of complex type N-glycans and live cell imaging of their protein conjugates2018

    • Author(s)
      Yoshiyuki Manabe, Masahiro Nagasaki, Hiroki Shomura, Naoya Minamoto, Soichiro Okamura, Shuto Miyake, Kanae Hatano, Kazuya Kabayama and Koichi Fukase
    • Organizer
      the 14th International Kyoto Conference on New Aspects of Organic Chemistry (IKCOC-14)
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Efficient syntheses of ABO blood type antigens and its immune evaluation2018

    • Author(s)
      Masato Tsutsui, Yoshiyuki Manabe, Koichi Fukase
    • Organizer
      the 14th International Kyoto Conference on New Aspects of Organic Chemistry (IKCOC-14)
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Synthesis and Anti-tumor Evaluation of At-211 Labeled Amino Acid Derivative for Targeted Alpha-particle Therapy2018

    • Author(s)
      Z. Zhang, K. Kaneda, A. Toyoshima, Y. Manabe, K. Kabayama, A. Shimoyama, A. Shinohara, K. Fukase
    • Organizer
      the 14th International Kyoto Conference on New Aspects of Organic Chemistry (IKCOC-14)
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Chemical syntheses of ABO blood type antigens using diacetyl strategy and investigation of their immune response2018

    • Author(s)
      Masato Tsutsui, Yoshiyuki Manabe, Koichi Fukase
    • Organizer
      The 3rd A3 Roundtable Meeting on Chemical Probe Research Hub
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Preparation of novel anticancer drugs using At-2112018

    • Author(s)
      K. Kabayama, K. Kaneda-Nakashima, Y. Manabe, A. Shimoyama, A. Toyoshima, A. Shinohara, K. Fukase
    • Organizer
      5th Asian Chemical Biology Conference (ACBC-5)
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Reconstruction of glycan environments2018

    • Author(s)
      K. Fukase, Y. Manabe, K. Kabayama, H. Ichikawa, S. Miyake, H. Shomura, T. Yamaji, K. Hanada, S.-C. Hung
    • Organizer
      5th Asian Chemical Biology Conference (ACBC-5)
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] SYNTHESIS OF COMPLEX TYPE N-GLYCANS2018

    • Author(s)
      Yoshiyuki Manabe, Masahiro Nagasaki, Hiroki Shomura, Naoya Minamoto, Soichiro Okamura and Koichi Fukase
    • Organizer
      29th International Carbohydrate Symposium (ICS 2018)
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] ハイスループットスクリーニングによるα1,6-フコシルトランスフェラーゼ (FUT8) 阻害剤の探索と構造展開2018

    • Author(s)
      武部智之、真鍋良幸、笠原里美、Yang XiaoXiao、高松真二、三善英知、樺山一哉、深瀬浩一
    • Organizer
      第99回日本化学会年会
  • [Presentation] 多分枝N-結合型糖鎖の網羅的合成を可能とする多様性指向型合成戦略の検討2018

    • Author(s)
      白川明日香、真鍋良幸、出村健太、増井誠二、深瀬浩一
    • Organizer
      第99回日本化学会年会
  • [Presentation] 超好熱性アーキアのN-グリカン担体脂質ドリコールの合成研究2018

    • Author(s)
      平尾宏太郎、真鍋良幸、小野莉紗子、深瀬浩一
    • Organizer
      第99回日本化学会年会
  • [Presentation] N-結合型糖鎖の効率合成とそれを用いた合成生物学的研究2018

    • Author(s)
      真鍋良幸
    • Organizer
      日本化学会新領域研究グループ「有機合成化学を起点とするものづくり戦略」最終研究成果発表シンポジウム
  • [Presentation] Z選択的Wittig反応を鍵とするドリコールの合成研究2018

    • Author(s)
      平尾宏太郎、真鍋良幸、小野莉紗子、深瀬浩一
    • Organizer
      第8回CSJ化学フェスタ2018
  • [Presentation] N-結合型糖鎖の効率合成とその機能解明を目指したライブセルイメージング2018

    • Author(s)
      真鍋良幸、長崎政裕、初村洋紀、 源 直也、岡村壮一郎、三宅秀斗、波多野佳奈枝、樺山一哉、田中克典、深瀬浩一
    • Organizer
      第60回天然有機化合物討論会
  • [Presentation] マイクロフロー系でのグリコシル化反応の開発:速度論支配のグリコシル化と不安定グリコシルドナー体の利用2018

    • Author(s)
      増井誠二、真鍋良幸、福山高英、柳 日馨、深瀬浩一
    • Organizer
      第7回 JACI/GSC シンポジウム
  • [Presentation] マイクロフロー系を用いた α-gal エピトープの効率合成とがん免疫療法への適用2018

    • Author(s)
      Julinton Sianturi、真鍋良幸、樺山一哉、深瀬浩一
    • Organizer
      第7回 JACI/GSC シンポジウム

URL: 

Published: 2019-12-27  

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