2018 Fiscal Year Annual Research Report
膜タンパク質における修飾糖鎖の機能解明を目指した細胞表面糖鎖ネットワークの解析
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16H05924
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
真鍋 良幸 大阪大学, 理学研究科, 助教 (00632093)
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2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 糖鎖 / 糖鎖合成 / レクチン / イメージング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では，膜タンパク質上のN結合型糖鎖（N-グリカン）が形成する相互作用ネットワークを解析し，N-グリカンが膜タンパク質の機能調節を行う分子基盤を解明する．まず，申請者がこれまでに確立した合成技術を活用して，N-グリカンの合成ライブラリを構築する．これをプローブとして用い，それぞれの糖鎖構造が膜タンパク質の動態に与える影響を明らかにするとともに，その動態変化を引き起こす相互作用分子を同定する．さらに，レクチン（糖鎖認識タンパク質）によるN-グリカン認識の構造基盤を解明する．
コアフコース，バイセクティンググルコサミン，ポリラクトサミン，末端ガラクトースおよび末端シアル酸の機能を調べるために，糖鎖ライブラリを合成した．昨年度までにコアフコース含有糖鎖およびバイセクティンググルコサミン含有糖鎖の合成を達成した．また，ポリラクトサミン含有糖鎖の化学酵素合成に行い，鎖長の異なる複数の糖鎖の合成も達成した．年度はN-グリカンの網羅的な合成を実現するために，多様性指向型の合成ルートを探索した．
GPIアンカータンパク質およびトランスフェリン受容体にHaloTagを融合したタンパク質をHeLa細胞に発現させた．HaloTagは，ハロゲン化アルキル（HaloTagリガンド）と低濃度で速やかに反応し，共有結合を形成する．ここではHalo Tagリガンドとして合成糖鎖を作用させ，純粋な合成糖鎖で標識したモデル膜タンパク質を調製する．昨年度までに糖鎖と蛍光基を導入したHaloTagリガンドを調製しており，これを細胞表面に提示できることをと示し，さらに，この手法で提示した糖鎖がレクチンに認識されることを示した．今後，この擬糖鎖修飾膜タンパク質の蛍光観察により，糖鎖修飾がエンドサイトーシスや膜上での拡散など膜タンパク質の動態に及ぼす影響を調べる．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究の肝は，N-グリカンの合成である．機能解明には，均一構造のN-グリカンを用いることが必須で，そのために化学合成を検討している．これまでに，N-グリカンの大量合成を指向し，さまざまな検討を行ってきた．精密条件下でのスケールアップが可能なマイクロフロー反応を有効に利用し，中間体となるフラグメント（2－4糖構造）を10 g以上のスケールで合成した．また，グリコシル化反応でのエーテル溶媒による反応中間体の安定化や，アミド（‐NHAc）のイミド（‐NAc2）保護による反応性向上の効果を見出した．巨大な糖鎖同士のグリコシル化において保護基のパターンを最適化することで，収率，立体選択性が劇的に向上することも示した．これにより重要な機能を持つコアフコース含有12糖とバイセクティンググルコサミン含有8糖の合成を達成した．またこの過程で，汎用性の高い合成ルートを採用しているため，多くのN-グリカンにこの合成法は適用可能である．実際，ここで確立した手法を用いて糖鎖骨格を構築し，その骨格に対して，酵素を用いた糖鎖伸張を行うことで，ポリラクトサミン鎖を含有する糖鎖の合成に成功した．
膜タンパク質の機能解明においては，HaloTagを用いた蛍光イメージングを行う予定である．すでにHaloTag発現細胞を調製し，合成糖鎖の提示に成功している．加えてこの合成糖鎖がレクチンに認識されることも確認している．現在，一分子蛍光観察を含めた種々の蛍光観察により詳細な動態評価に着手している．
加えて，糖鎖とレクチンの相互作用を原子レベルで解析するためにSTD-NMRを用いた実験を行う予定であるが，これに関してもすでに実験を始めており，この系が機能することを確認している．また，コアフコースを認識する新たなレクチンの探索も行っており，その候補となるタンパク質を突き止めるに至った．今後詳細な解析を行う予定である．
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| Strategy for Future Research Activity |
i) N-グリカンライブラリの構築：N-グリカンライブラリを合成する．これまでに確立した合成法を改良し，ポリラクトサミン鎖やシアル酸を含有する多分枝糖鎖を合成する．ポリラクトサミン含有糖鎖に関しては，糖鎖骨格を化学合成により構築し，酵素反応を用いてポリラクトサミン鎖を構築する．シアル酸含有糖鎖に関しては，我々がこれまでに開発してきたシアリル化反応を用いてシアル酸含有糖鎖を構築し，これを還元末端の糖鎖フラグメントに結合させる．ポリラクトサミン含有糖鎖はガレクチンとの，シアル酸含有糖鎖はシグレックとの相互作用を詳細に調べるために必須である．これらの糖鎖を効率的に合成するために，多様性指向型の合成ルートを検討しており，その確立を急ぐ．
ii) 糖鎖修飾膜タンパク質の動態解析と相互作用分子の同定：これまでに構築したHaloTagのシステムを用いて合成糖鎖を導入した膜タンパク質の動態解析を行う．これまでに，ポリラクトサミンやコアフコースがエンドサイトーシスを抑え，バイセクティンググルコサミンがエンドサイトーシスを促進することを示唆する結果が報告されているが，何れも生化学的実験からの間接的なデータである．そこで，合成した全ての糖鎖の挙動をイメージングし，この現象を明確に示す．特にガレクチンとシグレックが関与すると考えられる糖鎖に関してはこれらのレクチンを投与することでこの現象を明確に示す．
iii) 糖鎖‐レクチンの相互作用解析：ヒトが持つ10種類のガレクチンおよび11種類のシグレックのうち，まず，ガレクチン-1，3とシグレック-2に焦点を当て，糖鎖との親和性を調べる．シグレックに関しては市販されておらず，膜貫通部分を除いた糖鎖認識部位のみを発現させて用いる．まず，SPRにより糖鎖とレクチンの親和性を調べる．さらに，レクチンと強く相互作用した糖鎖はSTD-NMRによりレクチンの認識部位を明らかにする．
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[Journal Article] Synthesis And Immunological Evaluation of Self-adjuvanting Anticancer Vaccine Candidate.2019
Author(s)
Manabe, Y., Chang, T-C., Feng, Q., Fujimoto, Y., Ohshima, S., Kametani, Y., Kabayama, K., Nimura, Y., Lin, C-C., Fukase, K.
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Journal Title
Peptide Science
Volume: 2019
Pages: in press
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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