2016 Fiscal Year Annual Research Report
血中循環腫瘍細胞をターゲットとするリキッドバイオプシーで拓く高速癌診断システム
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16H06078
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
中島 雄太 熊本大学, 大学院先端科学研究部(工), 准教授 (70574341)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | アプタマー / 立体フィルタ / 血中循環腫瘍細胞 / 癌診断システム / リキッドバイオプシー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、がん細胞に多量に発現していると言われている上皮細胞接着分子（EpCAM）と特異的に結合するEpCAMアプタマーを基板に修飾する方法を確立した。具体的には、めっきにより基板表面に金薄膜を形成し、金表面に金‐チオール結合によりポリエチレングリコール誘導体自己組織化単分子膜を形成させた。この末端のヒドロキシル基をDSCにより活性化し、活性化したヒドロキシル基に末端をアミノ化したEpCAMアプタマーを修飾した。
製作した基板を用いて、がん細胞の捕捉実験を行った。実験にはCTCと同様に細胞膜上にEpCAMを高発現しているヒト由来のがん細胞とEpCAMの発現がないヒト由来の正常細胞を用いた。その結果、正常細胞に比べて効果的にがん細胞を捕捉することに成功した。また、EpCAMアプタマーの効果を検証するために、EpCAMアプタマーと同じ塩基を持ち、その塩基配列を変えたスクランブルDNAを基板上に修飾し、同様の捕捉実験を行った結果、正常細胞のみならず、がん細胞も捕捉されず、EpCAMアプタマーの塩基配列によって効果的にがん細胞が捕捉されることも確認した。このように、基板上への非特異的吸着が少なく、目的の細胞を特異的に捕捉可能な基板を製作できた。
一方、CTCの効率的な捕捉をアシストするためのフィルタの設計を行った。本フィルタは、液体の流れによる力を受けて平面形状から立体形状に弾性変形するフィルタである。本フィルタはフォトリソグラフィと精密電鋳により製作することを想定しており、これらの製作方法に合致する寸法設計や構造設計が重要である。本条件を満たすフィルタ構造を3種類設計し、解析ソフトを用いて流体解析を行ったところ、それぞれ流量に応じて線形的に立体変形することが確認できた。一方で、変形後のフィルタ形状や隙間寸法などの観点で改良すべき新たな設計指針を得ており、新たな設計を開始した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
EpCAMアプタマーや非特異的吸着を防ぐためのSAM膜の選定、それらの基板への修飾方法などが概ね完了した。また、それらの溶液濃度や修飾密度などの諸条件に関してもおおむね決定し、安定した修飾と実験が可能になった。また、効率的な捕捉をアシストするためのフィルタについては、流体解析結果のフィードバックにより、改良点や新たな設計指針を得ており、設計を開始している。また、設計の完了後すぐに製作に移れるように、同等寸法のサンプルを用いてフォトリソグラフィや精密電鋳を用いた製作方法やそれらの各種条件を検証済みである。上記のことから、今年度の達成度はおおむね順調であると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
効率的なCTCの捕捉をアシストするためのフィルタの設計を完了し、実際に製作する。製作のための条件は決定しているため、特に問題が起こることなく製作できると考えられるが、デザインや寸法が異なるため、歩留まり良く製作するための条件の微調整は必要になると考えてる。フィルタの完成後、フィルタにEpCAMアプタマーを修飾し、捕捉実験を行う。CTCは赤血球や白血球などの血液細胞よりもサイズが大きく歪な形状をしているため、CTCに特異的に発現するEpCAMとの特異的捕捉とサイズや形状を指標とした捕捉を同時に行うことができる。例えば、フィルタへの流体力を弱めて立体形状の「隙間」を狭くし、血液細胞を含む多くの細胞をフィルタに意図的に目詰まりさせた後、流体力を少しずつ大きくして隙間を広げることによって特異的に捕捉されたがん細胞のみをフィルタに捕捉できる。この実験により、流量と捕捉率の相関などを求めてフィルタの再設計や条件設定にフィードバックする。そして、効果的にがん細胞を捕捉できるデバイスの構築につなげる。その後、正常細胞中にがん細胞を混ぜた細胞懸濁液を用いて、捕捉効果を検証し、効果的にがん細胞を捕捉できる条件を導出する。
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