2018 Fiscal Year Annual Research Report
Improvement of Somatic Cell Nuclear Transfer technology by Epigenome-editing
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16H06146
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
的場 章悟 国立研究開発法人理化学研究所, バイオリソース研究センター, 専任研究員 (20585202)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 体細胞核移植 / クローン / ヒストン修飾 / ゲノムインプリンティング / エピゲノム編集 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
体細胞核移植法では体細胞核のエピゲノムを初期化し、クローン個体を作り出すことができるが、その効率は非常に低く未完成の技術である。これまでの申請者らの研究から、クローン胚の発生異常は、ドナー体細胞に存在するヒストン修飾の一種であるH3K9me3、および核移植後のXist 遺伝子の過剰発現が大きな原因であることを示している。また、上記の二つの異常原因を回避して作ったクローン胚でも、着床直後からは異常な表現型を示すことから、着床前の胚盤胞期には既にその後の発生異常の原因となるエピゲノム異常が存在することが強く示された。そこで、上記のようにして作製した胚盤胞期クローン胚のトランスクリプトームおよびエピゲノムを解析した結果、最近新たに発見されたヒストン修飾（H3K27m3）依存的なインプリント遺伝子が、クローン胚ではインプリント情報を失って両アリルから発現していることを発見した。実際に、微小スケールでのChIP-seq法を用いて着床前胚でのヒストン修飾（H3K27me3）の分布をゲノムワイドに解析した結果、クローン胚ではH3K27me3によるインプリント情報が失われていることを確認した。さらに、パブリックなデータベースを用いて、様々な体細胞でのヒストン修飾を解析した結果、ドナー体細胞の時点でこのインプリント制御に関わるヒストン修飾（母方アリルでのH3K27me3）が失われていることが明らかになった。これらの結果を国際誌に発表するとともに（Matoba et al., Cell Stem Cell, 2018 a）、体細胞クローンによる初期化メカニズムに関する総説も発表した（Matoba et al., Cell Stem Cell, 2018 b）。
また、上記の結果をもとに、H3K27me3を人為的に体細胞およびクローン胚に導入するエピゲノム編集技術の開発に挑戦している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
まず、計画していた通り、平成30年度までに着床前のクローン胚を用いてトランスクリプトーム・エピゲノム解析を進めて、体細胞核移植による初期化異常領域・およびそのパターンを理解することに成功し、論文として発表した（Matoba et al., Cell Stem Cell, 2018 a）。また、これまで我々をはじめとする様々なグループで行われたクローン胚のエピゲノム初期化解析の結果を包括的な総説として発表した（Matoba et al., Cell Stem Cell, 2018 a）。
これまで同定したエピゲノム異常のうち、H3K27me3依存的なインプリント遺伝子はその多くが胎盤形成や着床後の発生にかかわることから、この破綻がもっともクローン胚の発生効率に影響する可能性が高いと考えた。そこで、平成30年度後半からは、予定通り、H3K27me3をターゲットとしてエピゲノム編集技術を用いてその修復・補正を試みている。具体的には、H3K27me3の導入酵素であるPRC2を構成する必須因子、Eed, Suz12, Ezh1/2をクローニングし、これらをクローン胚で同時に強制発現させることでグローバルにH3K27me3を導入する実験を行った。その結果、明らかなクローン胚の胚発生の改善は認められなかった。おそらく、H3K27me3は様々な遺伝子の発現制御に広くかかわっていることから、今後はインプリント遺伝子のみをターゲットにしたアリル特異的なエピゲノム編集法を開発する必要がある。
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| Strategy for Future Research Activity |
最終年度となる平成31年度も、30年度に引き続き、H3K27me3によるインプリント制御の破綻について、その修正・修復を試みる。30年度はPRC2によるグローバルなエピゲノム編集を試みたが、グローバルがゆえに毒性もあるため期待通りの表現型回復の結果は得られなかった。そこで、アリル特異的なエピゲノム編集技術を検討する。CRISPR/Cas9技術を使うことで、アリル特異的なエピゲノム編集が可能であることが報告されているので、この手法をクローン胚に適応する。
一方で、H3K27me3によるインプリント遺伝子は数十個存在するため、効率的なエピゲノム編集を行ううえでは、どの因子がクローンの表現型異常に関連するのかを明らかにすることも重要である。そこで、CRISPR法によって個別の遺伝子のヘテロノックアウトマウスを作製し、それらの体細胞をドナーとして使用することで、クローンの遺伝子発現量を補正して表現型の原因となっている遺伝子を探る、という遺伝学的なアプローチも同時に行っている。
最後に、以上のようなエピゲノム編集・ドナーゲノム編集実験の結果、クローン胚で認められたトランスクリプトームおよびエピゲノム異常が回復するかを確認する。これらの分子レベルでの解析と同時に、クローン胚特有の着床後の異常な表現型が回復するかについても、胚移植実験によって確認する予定である。
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