2016 Fiscal Year Annual Research Report
Development of mRNA translational programing tools
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16H06157
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
八木 祐介 九州大学, 農学研究院, 学術共同研究者 (60612421)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | RNA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
最近、任意の塩基配列を標的できる分子の発見・開発・改良により、細胞内ゲノムを自在に操作する技術が誕生している。例えばヌクレアーゼを付加することで、ゲノムを改変するゲノム編集技術、または人工転写因子と融合することで、目的遺伝子の発現のON/OFFや活性化、不活性化を自在に行う技術が挙げられる。しかしながら、生体内では転写されたmRNAが蛋白質に合成される過程では多くの調節が行われており、最終産物である蛋白質の量と質は、mRNAの性質によって規定されている。既存のDNA操作技術ではそれらRNA分子へのアクセスができないため、生体内RNAの精密操作にはRNA操作技術の開発が必要である。そこで、本研究では、申請者ら独自の技術である塩基認識モジュールPPR（Pentatricopeptide repeat）蛋白質を使い、細胞内RNA操作ツールを開発する。PPRタンパク質は、植物で発見されたモチーフリピート型タンパク質である。これまでの研究からPPRタンパク質は、植物の葉緑体やミトコンドリアのRNAと配列特異的に結合することで様々なRNA調節を行っていることが分かった。申請者らは、このPPRの配列特異性を明らかにし、論理的な結合様式であることを見出し、これを基盤に、任意配列に結合するRNA結合タンパク質の作成技術を開発している。作成した人工PPRタンパク質と所望の機能を持つタンパク質を融合することで、例えばmRNAの翻訳量を操作するといったことが可能になると考えた。
本研究では、PPR作成技術を基盤に、タンパク質の翻訳量を変えるツールの開発、及びそれらを組み合わせた人工の遺伝子発現回路の設計・構築を目指している。本研究の完成により、細胞内の遺伝子発現制御を非常に精密に行うことが可能になると期待される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、mRNAの精密制御を目指し、１．mRNAの分解によるタンパク質翻訳阻害ツール。2. mRNA翻訳向上制御によるタンパク質量増強ツール。3. mRNA上での点変異によるタンパク質の性質改変ツールを開発し、将来的にそれらを組み合わせ、遺伝子発現回路を構築することを目的としている。本年度は、標的RNAに結合するPPRの作成、及びRNaseなどを融合したRNA分解ツールの概念実証を目指した。まず、タンパク質量を迅速かつスループットよく検出するためreporter遺伝子の選定を行った。GFP, RFPのような蛍光タンパク質。Firefly luciferase, Renilla luciferase, Nano-lucのような発光タンパク質発現プラスミドを作成し、HEK293T細胞へトランスフェクションし、検出感度などを比較した。結果Nano-luc (nluc)が非常に感度高く検出できるreporterであることが判明した。これまでの研究で作成できていた人工PPRタンパク質（PPRa）が標的する配列をnluc遺伝子の５UTR, 3UTR, 開始コドン直下に挿入したplasmidを作成した。さらにPPRaとRNaseを融合したタンパク質発現プラスミドを作成した。それらをHEK293Tへトランスフェクションしreporter活性を調べた結果、開始コドン直下に配置した場合に50%程度のレポーター発現の低下が見られたが、UTRの場合は10-20%程度しか低下しなかった。これらのことから標的を設定する際は、UTRを標的することは避けるべきだということが判明した。現在さらにnlucの翻訳領域に標的する人工PPRを作成中である。今後、その人工PPRを用いてreporter 発現を抑制できるか検証を行う。
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| Strategy for Future Research Activity |
抑制ツールについては、nluc対応のものを使い標的特異的にRNAを分解できるか検証を続けていく。また、平行して内在遺伝子を標的するPPRの作成を進め、RNase融合によるタンパク質合成阻害の概念実証を進めていく。標的としては、p53やVEGFといった遺伝子を想定している。２９年度はさらに、翻訳活性化を引き起こすことができるツールの開発を行う。これまでの研究でPPRを用いて翻訳のOn/Offするツールが作成できている。一方で翻訳をブーストすることはまだできていない。そこで、様々な翻訳開始因子、時計遺伝子の翻訳量をUp-regulateしている因子、Ribosome構成因子、ER関連因子などとPPRとを融合したタンパク質を用いて、概念実証を進める。前年度と同様に、どこへ標的を設定すれば可能か理解するために5´ or 3´ UTRや ORF内に標的配列を挿入したレポーターベクターを使い、RNA上のどの領域を標的にすれば効率よくタンパク質発現を活性化できるか明らかにする。さらに、標的塩基数やPPRの発現量の違いによるRNA分解効率への影響を調べることで、効果的にタンパク質発現を制御できる条件を明らかにする。さらに実際の内在遺伝子を標的とするPPRの作成も進める。CyclinBは、翻訳量が増すとがん細胞においてアポトーシスが起きることが分かっている。こういった翻訳量増大によりわかりやすい表現型がでる標的情報を収集し、それらに対応するPPRを作成する。これにより内在遺伝子が制御可能であるということを実証していく。
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