2017 Fiscal Year Annual Research Report
Analysis of the molecular mechanisms of RNA-directed DNA methylation
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16H06159
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
岩川 弘宙 東京大学, 定量生命科学研究所, 助教 (60710415)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | RNAサイレンシング / RNA-DNAハイブリッド / siRNA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成２９年度から平成３０年度８月にかけ大きく分けて３つの実験を実施した。以下にその概要を記す。
１.試験管内で小分子RNA依存的にDNAメチル化を促進する新規実験系を作成するため、DNAメチルトランスフェラーゼ（DRM2）および、メチル化補助因子の発現及び精製を行った。当初シロイヌナズナのAtDRM2を作成したが活性がなかったため、タバコ由来のDRM2（NtDRM2）の発現・精製を試みた。メチル化補助因子に関してはAtDRM2と相互作用が認められているAtRDM1とAtDRM2のホモログであるAtDRM3の発現・精製を行った。
２.リコンビナントのDRM2と、タバコ培養細胞抽出液（BYL）で発現し精製したAGO4を用いて相互作用解析を行った。その結果ネガティブコントロールであるLacZやRlucに比べてAGO4はDRM2と強く相互作用することが明らかになった。また、この相互作用は標的核酸非依存的に起こることも明らかにした。
３.過去の知見から、DRM2の基質は２本鎖DNAであることが示唆されている。そこで、AGO4-RISC標的配列以外の部分が二本鎖になるような内部ループ構造をもつ標的DNAを作成し、その標的DNAがAGO4-RISCと結合できるのかをフィルターバインディングアッセイによって解析した。その結果、内部ループ二本鎖DNAはAGO4-RISCの非常に良い標的になることを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
試験管内小分子RNA依存的DNAメチル化系は完成こそしなかったものの、①再構成に必要な必須タンパク質の発現・精製、②AGO4-DRM2の直接相互作用の発見、③天然に近いDNA基質にAGO4-RISCが強く相互作用することを発見したため、研究はおおむね順調に進んでいると評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの試験管内実験系を用いた研究結果より、24塩基の小分子RNAとAGO4、6、9から形成される3種類の核内RISCは、RNAよりDNAと強く結合することを見出している。一方で、21塩基の小分子RNAとAGO1およびAGO2から形成される細胞質RISCはDNAよりRNAと強く結合することを明らかにしている。これらの結果は、核内RISCが特異的にDNAと強く結合できることを示唆しているが、実際にDNAとの直接の結合が、DNAのメチル化に必要なのかは明らかになっていない。
この問題を解決するためには「標的RNAと強く結合するが、DNAとは結合しにくい核内RISCのDNAメチル化能」を調べることが鍵となると考えられる。21塩基の小分子RNAと結合する細胞質RISCはRNAを好む事から、21塩基の小分子RNAと核内AGOからRISCが形成されれば、DNAではなくRNAとの結合を好む核内RISCを作製できる可能性がある。しかしながら、そもそも、植物の核内AGOがどの様な効率で24塩基および21塩基の小分子RNAと結合するのか、また、どのタンパクドメインまたはモチーフが24塩基、21塩基の小分子RNAとの結合に重要な役割を果たしているのか、さらにはそのドメインを改変することで結合する小分子RNAの好みを改変することはできるのかなど不明な点が多い。今後は上記の問題を解決するため、核内AGOが取り込む小分子RNAの特徴を明らかにし、異なるAGO間でドメインスワッピングを行う予定である。
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