2017 Fiscal Year Annual Research Report
低分子量Gタンパク質R-Rasによる神経管形成制御機構の解析
| Project/Area Number |
16H06163
|
|---|
| Research Institution | Musashino University |
|---|
Principal Investigator |
大畑 慎也 武蔵野大学, 薬学部, 講師 (00442939)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
|
| Keywords | 神経管形成不全 / 平面細胞極性 / 低分子領Gタンパク質 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
神経管形成不全は、比較的発症頻度の高い神経疾患であり、その病理発症機序の理解は重要な課題である。神経管形成は、進化的に保存された平面細胞極性（PCP）制御因子群によって制御されており、これらの遺伝子の変異が神経管形成異常の原因となることが明らかになっている。
ゼブラフィッシュは、胚が透明で体外で発生し、かつ遺伝学的操作も容易であることから、神経管形成研究の良いモデル生物である。ゼブラフィッシュの脊髄は、神経板を構成する細胞が集団的な細胞移動を行った後に、正中線に沿った対称細胞分裂を行うことによって形成される。PCP因子の一つである4回膜貫通型タンパク質Vangl2の遺伝子に変異を持つ突然変異ゼブラフィッシュでは、細胞集団の移動が遅延するものの、対称細胞分裂の時期は影響されないため、脊椎が左右に二重に形成される（Tawk et al., 2007, Nature）。しかし、PCP因子がどのような情報伝達機構によって制御され、神経管形成に関わるのかについては、不明な点が多く残されている。
申請者は、神経幹細胞の細胞極性維持に関与する因子を探索する過程で、情報伝達経路の分子スイッチとして機能する低分子量Gタンパク質R-Rasの発現抑制が、vangl2突然変異体と同様の神経管形成異常を引き起こすことを見出した。CRISPR/Cas9ゲノム編集技術を用いてR-Ras変異ゼブラフィッシュを作出し、発現抑制実験の結果を確認した。さらに、R-Rasが結合するグアニンヌクレオチド型依存的にVangl2との結合強度が変化することを見出した。本研究は、神経管形成における低分子量Gタンパク質R-Rasの生理的役割の理解を拡大するだけではなく、神経管形成異常の病理発症機構を明らかにし、その診断・予防法開発に貢献することが期待される。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
野生型ゼブラフィッシュの脊髄神経管内腔は正中線上に形成される。我々は、神経幹細胞の細胞極性維持に関与する因子を探索する過程で、アンチセンスモルフォリノヌクレオチド（AMO）を用いて低分子量Gタンパク質R-Rasの発現を抑制すると、脊髄神経管内腔が左右に２つ形成されることを見出した。この神経管形成不全は、AMO耐性の野生型rras mRNAを注入することによって回復したことから、R-Rasは神経管形成に機能する事が期待された。近年、AMOは標的外効果（off-target effect）を引き起こすことが報告された。そこで、Crispr/Cas9システムを用いて遺伝子破壊ゼブラフィッシュ系統を作出し、発現抑制実験の確認を試みた。しかし、rrasヘテロ接合体から得られたrras変異体ゼブラフィッシュでは神経管形成異常は観察されなかった。母性rrasが胎生rrasの欠損を相補している可能性が考えられたことから、rrasヘテロ接合体のオスとrrasホモ接合体のメスを掛け合わせてrras変異体を得たものの、やはり神経管形成異常は観察されなかった。次に、rras欠損が、rras2やrras3などの他の遺伝子によって相補された可能性を考え、rras変異体にrras AMOを注入する実験を行なった。もしAMOによる神経管形成不全が標的外効果であるならば、rras AMOを注入したrras変異体でも神経管形成不全が観察されるはずである。しかし、この変異体では神経管形成不全は観察されなかった。以上の結果から、rrasは神経管形成に関与することが示された。
|
| Strategy for Future Research Activity |
rras AMOによって観察された神経管形成不全の表現型は、平面細胞極性制御因子Vangl2の変異ゼブラフィッシュ胚で観察されたものと類似している。そこで、R-RasとVangl2が物理的に相互作用するのかを検討する。物理的相互作用を検討するために、培養細胞にVangl2あるいは野生型や各種変異型（GTP結合型やグアニンヌクレオチド非結合型を模倣する点変異体）のR-Rasを強制発現させ、免疫沈降を行う。さらに、本研究で得られた神経管形成における低分子量Gタンパク質の機能の理解をさらに拡大するために、当研究室で単離した低分子量Gタンパク質の機能解析を行う。これらの分子に対するAMO注入がゼブラフィッシュ神経管形成に及ぼす影響を検討するとともに、各種シグナル伝達経路の活性も検討する。
|
Research Products
(1 results)
