The study of the self-recognition molecular mechanism in the Prunus-specific S-RNase based self-incompatibility

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16H06184
• Research Institution: Yamagata University
• Principal Investigator: 松本 大生 山形大学, 農学部, 助教 (30632129)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: サクラ属 / 自家不和合性 / S-RNase

Outline of Annual Research Achievements

本研究課題では、サクラ属のS-RNase依存性自家不和合性にみられる特異な「自己認識」システムの分子機構解明を目的に、作業仮説「自己特異的ジェネラルインヒビター(ＧＩ)分解モデル」を生化学的に検証することを計画している。本仮説では、和合花粉管は花柱誘導組織から取り込んだ毒性タンパク質S-RNaseをユビキチン化し分解に導く一方、不和合花粉管はS-RNaseのユビキチン化を担うジェネラルインヒビターがユビキチン化されることを想定している。2年目にあたるH29年度には、A）和合・不和合花粉管における自家不和合性関連タンパク質（S-RNase，SLFL2）のユビキチン化レベルの比較、およびユビキチン化タンパク質の網羅同定、B）対立遺伝子特異的なSFB抗体の作出を行う予定としていた．
A）まず自家・他家受粉雌ずいをサンプルとして、免疫沈降によりユビキチン化タンパク質を回収し、プロテインブロットによって目的タンパク質のユビキチン化を検出しようと試みた。花粉管伸長程度が同等である、受粉後9時間の和合受粉雌ずいおよび受粉後18時間の不和合受粉雌ずいの花柱上部1/3をサンプルとして解析を行ったものの、両サンプルにおいて自家不和合性関連タンパク質のユビキチン化は認められなかった。次に、S-RNaseを添加した培地上で培養した和合・不和合花粉管をサンプルとして同様の試験を行ったものの、こちらの試験においても自家不和合性関連タンパク質のユビキチン化は認められなかった。
B)S3、S4、S6ハプロタイプ特異的なSFBポリクローナル抗体を作出した。S3、S6ハプロタイプのSFB抗体については、組換えタンパク質に対するウェスタンブロットによってその特異性が確認できた。しかしながらいずれの抗体も免疫沈降に用いることはできなかった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

当初は和合・不和合反応を示している花粉管からユビキチン化タンパク質を回収し、網羅同定を行う予定であった。しかしながら、両花粉管からユビキチン化タンパク質を回収できたものの、和合・不和合反応の指標と期待されるタンパク質のユビキチン化が検出できなかったことから、今回用いた試験系では和合・不和合反応を示している花粉管からのユビキチン化タンパク質は回収できていない可能性があると判断した。

Strategy for Future Research Activity

今回の試験から、和合・不和合花粉管のユビキチン化タンパク質を網羅的に回収して解析を行うと、和合・不和合反応にかかわるユビキチン化のみを検出することが難しい可能性が考えられた。そのため今後は、タグ付き組換えS-RNaseを作出し、S-RNaseと結合する花粉内生タンパク質を網羅同定するとともに、和合・不和合反応時において組換えS-RNaseおよびS-RNase結合タンパク質のユビキチン化について検証する。