2016 Fiscal Year Annual Research Report
Structural organic chemistry in inhibitory mechanism of amyloid beta oligomerization
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16H06194
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
村上 一馬 京都大学, 農学研究科, 准教授 (80571281)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 脳神経疾患 / アルツハイマー病 / 有機化学 / 漢方生薬 / アミロイドβ / オリゴマー / NMR / 質量分析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
アルツハイマー病（AD）の原因物質であるアミロイド β（Aβ42）は，2あるいは3量体を基本単位としてオリゴマー（2 x nあるいは3 x n量体）化することにより神経細胞毒性を示す．最近，オリゴマー化に不可欠な凝集核形成過程のみを阻害する薬剤として，漢方・抑肝散の構成生薬であるチョウトウコウからウンカリン酸C（UA-C）を初めて同定した．UA-Cは，本研究代表者らがこれまでに明らかにした，強い核形成阻害に必要なカテコール構造を有さないことから，その作用機構に興味がもたれる．本研究では，Aβ42のオリゴマー形成阻害機構の解明を目的として，UA-CとAβ42オリゴマー（毒性オリゴマーを形成しやすい2および3量体モデル化合物）との結合様式を質量分析ならびに核磁気共鳴を駆使して明らかにする．さらに，UA-Cと同様の構造因子をもつ生薬由来の天然物についても同様の解析を行う．
昨年度までの研究によって，UA-Cの27位のフェルラ酸エステルおよび28位のカルボキシ基が阻害活性に不可欠であることが明らかになっている.今年度は，UA-Cの3位誘導体3種（メトキシ体，フェルラ酸エステル体，ケトン体）をそれぞれ合成し，構造活性相関を調べた．核形成阻害能の評価は，予めヘキサフルオロ-2-プロパノール処理したAβ42を用いて，チオフラビンT蛍光試験により行った．その結果，3位のかさ高い置換基が阻害活性を低下させることが判明した．またヒト神経芽細胞腫SH-SY5Yを用いたMTT試験の結果，UA-CはAβ42の細胞毒性を顕著に緩和するだけでなく細胞保護作用を示した．さらに，ナノエレクトロスプレー質量分析において，Aβ42の2 ~ 4量体を観測するとともに，これらとUA-Cとのイオン結合による付加体の存在を示唆するデータを得た．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
UA-Cはトリテルぺンアルコールとフェルラ酸が結合したエステルであり，既存のAβ42凝集阻害物質とは異なる新しいタイプの阻害剤である．昨年度までの研究で判明しているUA-Cの27, 28位に関する知見に加えて，3位について構造活性相関を調べた．3位誘導体の合成は27, 28位誘導体合成と同様に，チョウトウコウと同じアカネ科カギカズラ属であるUncaria elliptica R.Br ex G.Donから単離したsaponin Aを加水分解して得られるquinovic acidを出発物質として行った．凝集試験の結果，27位フェルラ酸エステルならびに28位カルボキシ基とは異なり，3位水酸基は阻害活性に必須ではないことが判明した．一方で，メチル基のような小さな置換基でも阻害活性が低下したことから，分子プローブなどの導入位置として，3位は適当ではないと考えられる．また，UA-CによるAβ42の毒性阻害活性および細胞保護作用より，副作用の少ないAD治療薬につながる可能性がある.さらに，従来のエレクトロスプレー質量分析法ではイオン結合を観測することは困難であったが，よりソフトなイオン化法であるナノエレクトロスプレー質量分析法を本実験に取り入れることによって，検出することに成功した．これらの結果より，UA-CはAβ42の凝集初期段階を標的とし，イオン結合を介して毒性オリゴマーの生成を阻害していることが示唆された．
以上により，本研究はおおむね順調に進展しているものと考えている．
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| Strategy for Future Research Activity |
UA-Cの毒性オリゴマー化阻害には，Aβ42モノマーおよびオリゴマーとの付加体形成を介している可能性があるので，オリゴマー測定が可能なイオンモビリティー質量分析（IM-MS）を用いて，UA-Cのカルボキシ基の付加体形成への寄与を調べる．次に，すでに合成法が確立している2量体モデル（疎水性C末端コア内で2価性のL,L-ジアミノピメリン酸で架橋した毒性オリゴマーを形成しやすいもの）を用いて，標的となる毒性オリゴマー種（2 x n量体）を同定する．続いて，2次元1H-15N SOFAST-HMQCスペクトルを用いて，UA-Cと相互作用しているAβ42モノマーのアミノ酸残基に関する知見を得る．またUA-C側の作用部位の情報を得るために，転移核オーバーハウザー現象（NOE）に基づいた飽和移動差（STD）スペクトルを測定する．一方で，UA-Cを用いた実験により明らかになった凝集核形成阻害に重要な構造因子について，タンジン，ダイオウおよびヤコウトウ等の他の生薬の主成分にも着目し，核形成への影響を調べることで本知見を検証する．
上記のAβ42の2量体モデルに加えて，3量体モデルの合成を開始する．本研究代表者らが提唱するC末端をコアとしたプロペラ型3量体モデルに基づいて，3価性の分子リンカーを合成し，Aβ のC末端で架橋した3量体の合成を試みる．
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