2017 Fiscal Year Annual Research Report
生細胞における超高解像度DNA多色イメージングによる分裂期染色体構造の解明
| Project/Area Number |
16H06212
|
|---|
| Research Institution | National Institute of Advanced Industrial Science and Technology |
|---|
Principal Investigator |
高田 英昭 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (20455207)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
|
| Keywords | クロマチン / 染色体 / CRISPR imaging |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では細胞内で複数のゲノムDNA配列を可視化し染色体凝縮時のDNAの時空間的挙動を明らかにし、染色体凝縮メカニズムの解明を目指している。本年度は、昨年度構築したDNA可視化に必要なベクターをヒト培養細胞（HeLa細胞）へトランスフェクションをし、標的配列のシグナルを細胞内で検出した。リピート配列であるテロメアとセントロメアのαサテライトを標的とするgRNAを作製して用いた。トランスフェクション後の細胞をスライドガラス上に展開し、FISHを行うことで標的シグナルが予想通り染色体のテロメアとセントロメアから検出され、CRISPR/dCas9を利用して標的DNAの動態を観測できることを確認した。しかしながら、2種類の蛍光蛋白質を用いた多色イメージングは、RNA結合蛋白質N22にRFPを結合させたものが核小体に蓄積してしまうため成功には至っていない。今後は、他のRNA結合蛋白質や他種族由来のdCas9を利用するなどして多色イメージングを試みるとともに、セントロメア、テロメア以外の染色体構造を標的としたgRNAを作製し、染色体構造の検出を試みる。分裂期におけるDNAの凝縮には蛋白質のリン酸化が関与すると考えられているが、染色体構造の一つである染色体スキャフォールド構造がKIF4Aとコンデンシンのリン酸化によって制御されているを明らかにし論文発表を行った。また、染色体の動原体構造に2価陽イオンの一つであるカルシウムイオンが関与することを明らかにし論文を発表した。このため、蛋白質のリン酸化やカルシウムイオンが染色体構造に与える影響を本イメージングシステムと超解像度顕微鏡法を組み合わせて詳細に解析する予定である。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
CRISPR/dCas9システムを利用して、テロメア、セントロメアをターゲットとして検出されたシグナルがそれぞれの構造に由来するシグナルであることをFISH法を用いて確認することができ、構築したベクターを用いて標的DNAを細胞内で検出可能であることを実証することができた。一方で、細胞内での多色DNAイメージングを行うために、gRNAの3’末端にRNAモチーフであるPP7及びboxBを付加し、それぞれのRNAモチーフに結合するタンパク質に蛍光蛋白質を融合したPCP-GFP及びN22-RFPを細胞内で発現させた。その結果、PCP-GFPは予想通り核内に局在し、標的配列からのシグナルを検出することができたが、N22-RFPは核小体に蓄積し、標的配列のシグナルの検出が困難であった。このため、他のRNA結合蛋白質とRNAモチーフの組み合わせを検討したり、複数種族由来の蛍光標識dCas9を利用することを検討している。また、カルシウムイオンが染色体の動原体構造の構築に関与し、カルシウムイオンの欠乏が染色体整列異常を引き起こすことを示し、論文発表ならびにプレスリリースを行った。
|
| Strategy for Future Research Activity |
細胞内での多色イメージングを行うために、RNAモチーフMS2を認識するMCPに蛍光蛋白質を融合させたものを用いる他、現在利用しているStreptococcus pyogenes由来のdCas9に加えてNeisseria meningitidis由来のdCas9のそれぞれに蛍光蛋白質を融合させることを検討する。現在可視化に成功しているテロメア、セントロメアの配列に加え他の配列についてもgRNAを設計し、核内及び染色体におけるDNA配列の分布を調べる他、染色体の凝縮因子である蛋白質のリン酸化やカルシウムイオンがセントロメアやテロメアといった染色体のDNA構造に与える影響を超解像度顕微鏡を用いて評価する。
|
