2016 Fiscal Year Annual Research Report
興奮-転写連関による転写遺伝子の特異的選択機構の解明
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16H06215
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
鈴木 良明 名古屋市立大学, 大学院薬学研究科, 助教 (80707555)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 薬学 / 薬理学 / 生理学 / 生体分子 / シグナル伝達 / イメージング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
①当研究室では、大コンダクタンスCa2+活性化K+（BK)チャネルが、細胞膜上のカベオラ構造を足場として電位依存性Ca2+チャネルと分子複合体を形成して、平滑筋の興奮性を制御することを明らかにしてきた（Suzuki et al., 2013）。横紋筋において、細胞膜と筋小胞体が結合膜構造（JMC）と呼ばれるシグナルドメインを形成することが知れられており、その主要な因子としてjunctophilin2 (JP2)が挙げられる。平滑筋においてもJMCが存在するがその構造基盤は不明であった。そこで我々は平滑筋におけるJP2の役割に着目した。１分子イメージングにより、腸間膜動脈平滑筋細胞において、JP2がcaveolin-1やBKチャネル、リアノジン受容体（RyR)と複合体を形成することを明らかにした。また、JP2のノックダウンにより、自発性一過性外向き電流は有意に減少した。以上より、JP2がカベオラ構造を介してRyRとBKチャネルを近接化させて、平滑筋の静止張力を安定化させていることが明らかになった。本成果は現在論文投稿中である。
②遺伝子導入系の確立：収縮型のフェノタイプを維持した平滑筋細胞（C-SMC）に、蛍光標識したタンパク質やFRETプローブ、Gene-encoded Ca2+ indicator (GECI)などを発現させるには、in vivoあるいは組織培養下で遺伝子導入する必要がある。そこで本年度ではアデノ随伴ウイルス（AAV）による遺伝子導入系の一部を確立した。
③FRETプローブおよびGECIの最適化：Addgeneより各種FRETプローブやGECIを入手し、プラスミド配列の最適化と各蛍光プローブ類のバリデーションを行った。
④マウス腸間膜動脈に対して脱分極刺激・あるいはアゴニスト刺激を与えた際に起こる興奮-転写連関(E-T coupling)の評価法を確立した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
①平滑筋におけるJP2の生理的な意義を初めて明らかにした。これまでJP2は横紋筋においてJMCを形成して、筋収縮時の細胞内Ca2+濃度増幅機構に重要であることが明らかにされてきた。本成果は、平滑筋においてはJP2が筋の静止張力を安定化させる、すなわち筋の興奮性を抑える方向に働くという新たな概念を提唱した。現在研究結果をまとめ論文作成中である。
②E-T couplingの再現と評価法の確立：E-T couplingについて、神経細胞では多くの研究がなされているが、平滑筋を標的とした研究は数グループしか行っておらず報告もごく僅かである。本年度は平滑筋において、脱分極刺激あるいはアゴニスト刺激によってE-T coupling（CREBのリン酸化）が実際に急性単離した細胞・組織で起こることを再現した。これにより、今後caveolin-1遺伝子欠損マウスなどとその効率を比較することが可能となった。
③AAVによる遺伝子導入法の一部確立：AAVを用いてマウス気管支平滑筋組織にshRNAを導入することに成功した。今後、分子サイズの小さい蛍光プローブを平滑筋組織に導入してイメージング解析を進める予定である。GECIやFRETプローブをコードしたプラスミドの配列（マルチクローニングサイトなど）の最適化や、当研究室のイメージングシステムで期待通りに働くかのバリデーションも概ね完了している。従って、順次ウイルスベクターに導入して平滑筋組織あるいは単離・培養下の平滑筋細胞に導入していくことが可能である。
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| Strategy for Future Research Activity |
①C-SMCにおけるE-C/E-T couplingドメイン（それぞれECC、ETC）の細胞内分布の解明：ECC・ETCドメインの分布と[Ca2+]上昇パターンを蛍光イメージングによってマッピングし、両者の関連を調べる。プラスミド配列の最適化・バリデーションを行った各種蛍光プローブをウイルス発現系によってC-SMCに導入し、両ドメインの選択的な可視化を行う。AAVは感染後遺伝子発現が遅いため、アデノウイルスによる遺伝子導入系も同時に検討する。
②E-T couplingの多様性と特異性を生む機構の解明
(②-1) C/P-SMCにおけるE-T coupling過程の可視化解析：これまでに、C-SMCではcaveolin-1およびJP2が平滑筋興奮時および静止時において重要であることを明らかにした。本年度では、in vitro系における平滑筋細胞の分化・脱分化のコントロール法の確立し、P-SMCにて機能する足場タンパク質の同定および[Ca2+]上昇と下流シグナル伝達の可視化を行う。
(②-2) 表現型切り替えスイッチの探索：昨年度はRhoA/ROCKの蛍光標識体およびFRETプローブの作製・バリデーションを行った。本年度は組織培養由来のC-SMCあるいはin vitro下で分化させたC-SMCを用いて、足場タンパク質による、脱分極刺激後のRhoA/ROCK細胞内局在・活性変化および下流の転写因子発現への関与を明らかにする。
③オルガネラ間のCa2+シグナル連関とその基盤となる機構の解明：入手したCa2+プローブ（GECOやCEPIAなどのGECI）をC-SMCあるいはP-SMCに導入し、細胞質内、SR内および核内のCa2+濃度（[Ca2+]cyt, [Ca2+]SR, [Ca2+]nuc）を測定する手法を確立する。
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