2017 Fiscal Year Annual Research Report
ゲノムに局在するユビキチン様修飾分子Ufm1による生活習慣病防御機構の解明
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16H06221
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
渡部 昌 北海道大学, 医学研究院, 助教 (10632424)
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2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | Ufm1 / ゲノム / クロマチン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
①FLAG-UFM1発現細胞株の樹立：CMVプロモーターの下流にFLAG-UFM1を組み込んだレトロウイルスベクターを作製した。このベクターを用いてレトロウイルスを作製し、FLAG-UFM1安定発現HEK293T細胞株を樹立した。同様にして、FLAG-UFM1安定発現MCF7細胞株を樹立した。
②質量分析によるUFM1化タンパク質の同定：HEK293T細胞株を用いて、1%SDSを含む溶解バッファーで溶解後に90℃で10分間加熱して変性し、FLAG-UFM1と他の分子の共有結合以外の相互作用を破壊した。SDSを含んでいない溶解バッファーで10倍希釈後に抗FLAG抗体を用いて免疫沈降することでUFM1と共有結合したタンパク質のみを精製し、質量分析器による解析を行った。この結果、約100個のUFM1化タンパク質候補を得た。これらの中には、過去に基質として報告されているUBA5、UFC1、DDRGK1などが含まれていた。また、MCF7細胞株を用いて、同様に溶解後に変性し、抗FLAG抗体を用いて免疫沈降してUFM1と共有結合したタンパク質のみを精製し質量分析器による解析を行ったところ、約90個のUFM1化タンパク質候補を得た。多くはHEK293T細胞での結果と一致しており、UBA5、UFC1、DDRGK1といった既知の基質も含まれていた。また、これらの分子群の中には、転写制御因子が複数含まれていた。
③実際に一部の分子について細胞内でのUFM1化を検証し、実際にUfm1化を受けていることを確認した。
④ChIP-seq解析時のさらなる条件検討を行い、より最適な条件を見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
計画していた実験が概ね遂行できており、今年度に得られた知見を元に来年度もさらに研究を進展させる段階にあるため。
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| Strategy for Future Research Activity |
ChIP-seq解析におけるよりよい条件を評価し、現時点で最適な条件を見出した。この条件を元に、さらに詳細なChIP-seq解析を行う。
その他についてはおおむね計画通りに遂行されているため、現在のところ変更はない。
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[Journal Article] Mutations in bassoon in individuals with familial and sporadic progressive supranuclear palsy-like syndrome.2018
Author(s)
Yabe I, Yaguchi H, Kato Y, Miki Y, Takahashi H, Tanikawa S, Shirai S, Takahashi I, Kimura M, Hama Y, Matsushima M, Fujioka S, Kano T, Watanabe M, Nakagawa S, Kunieda Y, Ikeda Y, Hasegawa M, Nishihara H, Ohtsuka T, Tanaka S, Tsuboi Y, Hatakeyama S, Wakabayashi K, Sasaki H.
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Journal Title
Sci. Rep.
Volume: 8
Pages: 819
DOI
Peer Reviewed
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