2016 Fiscal Year Annual Research Report
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16H06223
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
山口 新平 大阪大学, 医学系研究科, 助教 (80740795)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | インプリンティング / 胚性幹細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ES細胞は着床前初期胚の胚盤胞を培養することによって樹立されるが、片アレル性遺伝子発現を示すインプリンティング遺伝子はこの樹立過程でインプリンティングを喪失して両アレル性遺伝子発現を示すことがわかっている。この生理的意義と分子機構は不明であった。そこで、まず、いつ、どのようにインプリンティング喪失が生じているのかを明らかにするために、樹立過程における遺伝子発現プロファイルを解析した。胚盤胞とES細胞のRNAシーケンシングの結果を解析すると、父性発現遺伝子のインプリンティング喪失が顕著であったことから、母性ゲノムしか有しない雌性単為発生胚盤胞をES細胞樹立用の培地で培養し、遺伝子発現を解析した。その結果、インプリンティングの喪失は培養開始2-3日ですでに認めらていた。 インプリンティング喪失を野生型で、単一細胞レベルで詳細に解析するために 、ES細胞において特に発現が高い父性発現遺伝子Phf17遺伝子に緑色、赤色蛍光タンパク質遺伝子を挿入したレポーターマウスの作製を開始し、それぞれのレポーターマウスの樹立に成功した。胚盤胞の時点でいずれかのインプリンティングを全く持たない単為発生胚からES細胞の樹立を行うと、樹立効率が雌性、雄性単為発生胚の両方で効率が低く、その傾向は特に雄性単為発生胚で顕著であった。Phf17を欠損したES細胞は増殖に顕著な低下が認められることから、インプリンティングの喪失は生体外で安定した増殖を実現するための基盤として機能している可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ES細胞樹立の過程でのインプリンティング喪失のタイミングの同定、父性発現インプリンティング遺伝子Ph17の発現をそれぞれのアレルで異なる蛍光タンパク質の発現でモニターできるレポーターマウスの樹立、Phf17のノックアウトによる増殖低下の表現型の確認、単為発生胚からのES細胞樹立の解析などを完了することが出来、概ね順調に進展していると評価できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後はインプリンティング破綻が樹立の過程でどのようなタイミングで、どのような機構で生じているのか、を明らかにするために、 Phf17レポーターマウスを用いた解析を行う。まずは父母アレルで異なるレポーターを有する胚盤胞を回収し、培養過程でどのようにインプリンティング破綻して二重陽性となっていくのか、そのような細胞はどのような性質を有しているのかを免疫染色や単一細胞RNAシーケンシングなどを通じて解析する。また、なぜインプリンティングが破綻しているのかを明らかにするために、エピジェネティック状態の制御因子の発現動態を解析し、ノックダウンや強制発現実験、さらに培養条件の検討などを行ってインプリンティングが維持されているES細胞の樹立を試みる。また、単為発生胚からのES細胞樹立の効率低下がどのような機構で生じているのかも明らかにするために、単為発生胚と受精胚で異なる遺伝子発現を解析し、責任因子の同定を試みる。
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