2016 Fiscal Year Annual Research Report
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16H06229
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| Research Institution | Chiba University |
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Principal Investigator |
後藤 義幸 千葉大学, 真菌医学研究センター, 准教授 (10755523)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 腸内細菌 / 感染 / Fut2 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究ではSalmonella typhimurium感染に対する腸管上皮細胞が発現するalpha1, 2-フコースの感染防御効果を検証することを目的としている。平成28年度は上皮細胞のalpha1, 2-フコースがS. typhimuriumに直接的な防御作用を示す可能性を検証するため、villinプロモーターにFut2遺伝子とエンハンサーを繋いだベクターを作製し、腸管上皮細胞特異的にFut2を発現させた遺伝子改変マウスを作製した。これらのマウスでは、腸管上皮細胞において恒常的にalpha1, 2-フコースが高発現していた。現在、Fut2遺伝子改変マウスの無菌化をすすめており、本年度はビニールアイソレーターにおいてS.tyhimuriumを感染させ、感染状態を野生型無菌マウスと比較検討する予定である。一方、マウスではセグメント細菌が腸管上皮細胞のalpha1, 2-フコースを誘導するが、これまでalpha1, 2-フコースを誘導するヒト腸内細菌は不明であった。本年度はalpha1, 2-フコースを誘導するヒト腸内細菌を同定するために、ヒト腸内フローラマウスを樹立した。これまでに、樹立したヒト腸内フローラマウスにおいてフコシル化上皮細胞の誘導を観察している。上皮細胞のalpha1, 2-フコースは、3型自然リンパ球によって誘導されることが知られているが、Th17細胞の関与についての情報は限定的であった。本年度は、alpha1, 2-フコース誘導におけるTh17細胞の役割を明らかにするために、T細胞欠損マウスにRorgammat欠損マウス由来のT細胞を移入することでTh17細胞特異的欠損マウスを作製した。その結果、野生型T細胞を移入した場合と同等のFut2の発現ならびにalpha1, 2-フコシル化上皮細胞が観察された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでに、Salmonella typhimurium感染に対するalpha1, 2-フコースの直接的な防御作用を示す可能性を検証するため、腸管上皮細胞においてalpha1, 2-フコースを恒常的に発現する遺伝子改変マウスを樹立し、実際に腸管上皮細胞においてalpha1, 2-フコースが恒常的に発現していることを確認した。現在、このマウスの無菌化を進めており、順調に研究は進展している。
また、腸管上皮細胞においてalpha1, 2-フコース発現を誘導するヒト腸内細菌を同定するために、ヒトフローラマウスを作製し、抗生物質処理法を用いて実験を進めている。また嫌気培養装置を使い、alpha1, 2-フコースを誘導する腸内細菌の単離も進めており、研究は順調に進んでいると考えられる。
さらに、腸管上皮細胞のalpha1, 2-フコース発現におけるTh17細胞の役割を明らかにするために、Th17細胞特異的欠損マウスを作製しalpha1, 2-フコースの発現を観察したところ、コントロールと差がみられなかったことから、Th17細胞はalpha1, 2-フコースの発現には必要ではなく、3型自然リンパ球が重要であることが示された。alpha1, 2-フコースを誘導するサイトカインであるIL-22はILC3とTh17細胞から産生されることが知られており、なぜILC3が特異的にalpha1, 2-フコースを誘導するのか大変興味深く、重要な知見と言える。以上の結果から、研究は順調に進んでいると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでのところ研究は順調に進んでおり、今後も計画通りに研究を推進する。野生型またはFut2欠損マウス由来の糞便を無菌マウスに移植してS. typhimuriumを感染させ、S. typhimurium感染に対する腸内細菌の役割を明らかにする。防御効果が観察された場合は、Fut2欠損マウスにおいて減少していることが報告されているLactobacillusやClostridiumなどの腸内細菌に着目し、ヒトおよびマウスの糞便からLactobacillusやClostridiumを嫌気条件下でMRS培地やReinforced Clostridium培地を用いて培養し、単離する。単離した細菌を用いて同属細菌の生菌カクテルを作成して共培養系や無菌マウスに供することで、S. typhimuriumの増殖や遺伝子発現に与える影響をin vivoおよびin vitroにおいて明らかにする。
さらに、腸管上皮細胞のalpha1, 2-フコースを誘導するヒト腸内細菌を嫌気条件下で単離する。これまでに、ヒト腸内細菌はalpha1, 2-フコースを誘導するという結果を得ており、今後は次世代シークエンサーを用いた解析を行うとともに各種細菌を培養法にて単離する。単離した細菌を用い同属の生菌カクテルを作成して無菌マウスに投与し、alpha1, 2-フコースを誘導するヒト腸内細菌を同定する。
上皮細胞のalpha1, 2-フコースを誘導する免疫因子として、本年度はILC3とTh17から産生されるIL-22が異なる作用を示す理由について研究を行う。特にTh17とILC3からのIL-22発現量やIL-22発現細胞の絨毛部位における局在を明らかにすることで、Th17とILC3によるIL-22の役割の違いを明らかにする。
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