2016 Fiscal Year Annual Research Report
骨髄造血の恒常性維持を担うニッチの動態と機能の解析
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16H06232
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
尾松 芳樹 大阪大学, 医学系研究科, 助教 (80437277)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 造血幹細胞 / ニッチ / CAR細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
造血の恒常性はニッチと呼ばれる特殊な微小環境によって高度に維持されていると考えられ，申請者らはこれまでに，骨髄に存在するケモカインCXCL12を高発現する細網細胞(CAR細胞)が，造血幹細胞・前駆細胞の維持に必須のニッチを構成する特別な間葉系前駆細胞であること，およびその形成と維持に転写因子Foxc1が必須であることを明らかにしてきた．そこで本研究ではCAR細胞の機能と動態に着目し，骨髄造血の恒常性がどのようにして維持・制御されているのかを解明することを目的としている．
まずは転写因子Foxc1によって制御される，造血の恒常性維持に必須の新規造血制御因子を同定するために，Foxc1コンディショナルノックアウトマウスを用いFoxc1欠損によって変化するCAR細胞の遺伝子発現を解析した結果，Foxc1が制御する可能性のある新規造血制御遺伝子の候補をいくつか同定した．この遺伝子が実際にFoxc1の制御下にあるか否かを培養細胞にFoxc1を強制発現させる等の方法で検討を行っている．また同時にその遺伝子がCAR細胞の造血支持能に重要であるか否かをコンディショナルノックアウトマウスを用いて検討できるよう計画している．
次に，造血異常を引き起こす種々の処置によるCAR細胞の変化の解析するため，まずは低容量放射線照射，脱血，LPS等のTLRリガンド投与などの処置の中から，CAR細胞の変容と造血の変化がよく相関するようなモデルを選択するための予備実験を行っている．なかでもCAR細胞のFoxc1発現の変化を来すモデルについてはより有用であると考え，より詳細な条件検討を行っている．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
転写因子Foxc1によって制御される，造血の恒常性維持に必須の新規造血制御因子を同定するために，Foxc1コンディショナルノックアウトマウスに少ないながらに残存するCAR細胞を単離し，野生型マウスのCAR細胞と遺伝子発現を解析した．その結果，Foxc1が制御する可能性のある新規造血制御遺伝子の候補を複数同定することができた．そこで，この遺伝子が実際にFoxc1の制御下にあるか否かを培養細胞にFoxc1を強制発現させる等の方法で検討を行っている．また同時にその遺伝子がCAR細胞の造血支持能に重要であるか否かをコンディショナルノックアウトマウスを用いて検討するために，floxマウス作成の計画に着手している．
次に，造血異常を引き起こす種々の処置によるCAR細胞の変化の解析するため，マウスに低容量放射線照射，脱血，LPS等のTLRリガンド投与などの処置を行い，経時的にCAR細胞を調整すると共に造血の変化を測定した．その際のCAR細胞の遺伝子発現の変化を測定したところ，いくつかの実験モデルにおいては造血の変化との間によい相関が認められた．なかでもCAR細胞のFoxc1発現が一過的に変化するような実験モデルについてはより有用であると考え，より詳細な条件検討を行っている．
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの研究によって，CAR細胞における機能が明らかでないが，発現の特異性があり，かつすでに必須の機能が証明されている転写因子Foxc1によって制御される可能性が高い遺伝子がいくつか同定された．これらの遺伝子はCAR細胞の担う造血の恒常性維持において重要な役割を持っている可能性が考えられる．これらの候補遺伝子について，CAR細胞における機能を明らかにするためにはin vitroの実験だけでなくコンディショナルノックアウトマウスの解析が不可欠である．そこでfloxマウスを作成し，これら候補遺伝子の機能の解明を目指す．
また，造血の異常を来す種々のストレスに応答してCAR細胞の遺伝子発現が変化することが観察された．この遺伝子発現変化は造血の回復に対して正の効果をもたらす場合と負の効果をもたらす場合が考えられる．いずれの場合においてもCAR細胞による造血制御機構に重要な遺伝子であると考えられるので，その機能を解明するためにコンディショナルノックアウトマウスを用いた実験を計画している．
さらに，造血幹細胞やB前駆細胞の数や割合は成長や老化によって変動することが知られているが， CAR細胞のサイトカイン産生能・細胞増殖能・細胞分化能が変化するか否かは明らかでない．そこでマウスの発生・成長段階ごとにCAR細胞の遺伝子発現の変化を解析し，CAR細胞の成熟を促す可能性のある細胞内外のシグナルや，成熟に伴って発現が上昇する機能遺伝子の候補を同定する．
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