2016 Fiscal Year Annual Research Report
オミクス技術を駆使した包括的ALS 治療戦略の確立
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16H06247
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| Research Institution | Tokyo Medical University |
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Principal Investigator |
金蔵 孝介 東京医科大学, 医学部, 講師 (10508568)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ALS |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究ではオミクス技術を駆使し、C9orf72変異による神経細胞死機構を解明し、小分子化合物スクリーニングを通してALS根治薬を開発することを目標としている。本年は液体クロマトグラフィーマススペクトロメトリーによるプロテオミックスクリーニングとCRISPRを用いたゲノミックスクリーニングを進めた。GFP-poly-PRおよびGFP-poly-GAを発現した細胞を用いた網羅的プロテオミックスクリーニングによりこれらのジペプチドとの新規結合因子群を同定した。特にpoly-PRについては以前のスクリーニングで同定した蛋白に加え、数百種におよぶRNA結合蛋白質群が同定され、現在それらの機能解析を進めている。次にCRISPR遺伝子破壊ライブラリーを発現した細胞をpoly-PRジペプチド処理し、遺伝子破壊スクリーニングを施行した。HiSeqを用いた次世代シーケンサーで細胞死に必要な経路の探索を行った。一度目のスクリーニングを終了し、２度目のスクリーニングを行っている。
創薬標的についてより詳しい検討を行っており、RNAおよびRNA結合蛋白とジペプチドとの結合機構について詳細なメカニズムを解明し、現在論文執筆中である。また、創薬スクリーニングのシステムの構築のためオートドロッパーを導入した。
次年度以降の新規ALS動物モデル作成のためのアデノ随伴ウイルスベクターの作成を完了し、細胞モデルで目的の蛋白質が発現することを確認した。次年度よりマウス脳室内投与を開始し、神経機能の評価および病理学的評価を行う予定である。また、次年度以降の細胞モデル樹立のためのC9orf72変異ALS患者由来の細胞株を米国より輸入し、その表現系を解析している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究ではオミクス技術を駆使し、C9orf72変異による神経細胞死機構を解明し、小分子化合物スクリーニングを通してALS根治薬を開発することを目標としている。今年度は予定した通り、LC-MS/MSを用いたプロテオミックスクリーニングとCRISPRライブラリーを用いたゲノミックスクリーニングを遂行し、それぞれ非常に興味深い結果が得られている。ゲノミックスクリーニングについては再現性をとるため、実験を繰り返している。また、次年度以降の新規ALS動物モデル作成のためのアデノ随伴ウイルスベクターの作成を完了し、細胞モデルで目的の蛋白質が発現することを確認した。次年度よりマウス脳室内投与を開始し、神経機能の評価および病理学的評価を行う予定である。
小分子スクリーニングの準備も整えているが、より創薬標的を分子レベルまで絞り込むためにRNAおよびRNA結合蛋白とジペプチドとの結合機構について詳細なメカニズムを解明した。今後創薬標的となりうる分子について検討を進める。また、次年度以降の細胞モデル樹立のためのC9orf72変異ALS患者由来の細胞株を米国より輸入し、その表現系を解析している。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究ではオミクス技術を駆使し、C9orf72変異による神経細胞死機構を解明し、小分子化合物スクリーニングを通してALS根治薬を開発することを目標としている。今後プロテオミックスクリーニングおよびゲノミックスクリーニングを通して得られた結果をもとに、C9orf72遺伝子由来ジペプチドによる神経細胞死機構の全貌を解明する。特に創薬標的となりうる分子を同定し、小分子スクリーニングを行うことによってALSの治療薬開発を目指す。小分子スクリーニングを行うにあたり、徹底的に分子を絞り込み、なるべく創薬標的が分子レベルでわかるようにする。またアデノ随伴ウイルスを用いた新規モデル動物の開発と患者由来細胞を用いたin vitro疾患モデルの開発を行い、これらのモデルを用いてスクリーニングで同定された分子の治療効果を検討する予定である。モデル動物についてはウイルスの作成が終了したため、本年度からマウス脳室内に投与を開始する。行動試験および病理組織観察により、疾患モデルとしての適性を評価する。また、in vitroモデルとしてはC9orf72変異患者由来線維芽細胞とiPS細胞をすでに入手したことから、今後induced Neuronの樹立を行い、in vitroでの表現系について詳細に検討するとともに、治療薬候補化合物の評価系として使用可能か検討する。
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