ヒトゲノム編集細胞を使った、化学物質の薬理作用・有害性を解析するシステムの構築

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16H06306
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 武田 俊一 京都大学, 医学研究科, 教授 (60188191)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 笹沼 博之 京都大学, 医学研究科, 准教授 (00531691) ; 津田 雅貴 京都大学, 医学研究科, 特定助教 (00734104) ; Brown John 京都大学, 医学研究科, 講師 (90583188) ; 廣田 耕志 首都大学東京, 理工学研究科, 教授 (00342840) ; 安井 学 国立医薬品食品衛生研究所, 変異遺伝部, 主任研究官 (50435707)
• Project Period (FY): 2016-05-31 – 2021-03-31
• Keywords: トキシコロジー / 人体有害物質 / 遺伝毒物学 / 発がん物質 / 変異原 / TK6細胞 / ケモインフォマティクス

Outline of Annual Research Achievements

我々は本研究課題において、ヒトTK6（化審法が変異原性化学物質を検出する為のバイオアッセイで利用することを推奨）由来のゲノム編集細胞を作製・利用することによって変異原性化学物質を同定、分類分けする研究を提案した。本研究助成を受けたグループは、合計で100種類以上のゲノム編集TK6細胞（TK6ミュータント）を作製し、そのリストをネットに公開した（http://www.nihs.go.jp/dgm/tk6.html）。企業も含めTK6ミュータントを譲渡依頼してきた複数の研究機関宛にTK6ミュータントを2016年度に発送した。
TK6ミュータントを利用した基礎研究によって、変異原性の作用機序を解析し、合計17報の論文を発表した。この中には笹沼准教授がシニアオーサーとして発表したMol Cell 2017も含まれる。この研究は、トポイソメラーゼ２（Top2）の触媒反応（DNA２重鎖切断を一過性に作りながら2本の２重鎖DNAの絡みをほどく）の失敗が頻回に起こり病的DNA２重鎖切断が各細胞において毎日複数回自然発生していることを解明した。DNA２重鎖切断は、最も発がん性の強い変異（染色体転座、染色体欠失、長いDNA断片の欠失）に変換される。我々の研究成果からDNA２重鎖切断が自然発生する主要な原因は、(i)DNA複製が鋳型鎖の損傷部位で停止することと、(ii)Top2の触媒反応の失敗であることが判った。
本研究グループはin silico の変異原性検出手法の開発を将来の最終目的とする。目的を達成するには、ケモインフォマティクス（化合物の化学構造からその薬理作用や有害性を、コンピューターを使い予測）と呼ばれる手法を利用する。分担研究者（2016年に京大医で独立したブラウン講師）は、ケモインフォマティクスの新手法開発に関する論文を自分がシニアオーサーとして初めて発表した。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

武田研究室と分担研究グループの廣田研究室（首都大学東京）、ブラウン研究室（京大医）、本間研究室の安井研究員（国立医薬品食品衛生研究所）が論文を合計20報発表した。武田研究室が発表した論文は7報（論文リスト：1, 2, 4, 6, 8, 9, 14）、廣田研究室が発表した論文は6報（論文リスト：5, 10, 11, 16, 17, 18）、ブラウン研究室が発表した論文は1報（論文リスト：15）、本間研究室が発表した論文は2報（論文リスト：19, 20）であった。論文リストの12はYves Pommier（米国National Institute of Health）が、論文リストの3, 7, 13は中村純 准教授（ノースカロライナ大学）がそれぞれ発表した。このようにDNA毒性評価分野の専門家と国際共同研究し成果をあげた。我々は十分な数の論文発表した、と自己評価する。
論文リスト4は、2016年11月にMol Cell（インパクトファクター：13.95）に笹沼准教授（京大・放射線遺伝学）がシニアオーサーとして発表した。本研究は、染色体断裂の自然発生機構を新たに同定したものである。Nucleic Acids Res.（インパクトファクター：9.20）に発表した論文リスト11は、DNA複製酵素が損傷した鋳型鎖を使ってDNA合成することを発見した論文である。DNA複製酵素は、従来推定されてきた頻度より高い頻度で変異を起こしうるのである。論文リスト１は、OncoTarget（インパクトファクター：5.00）に発表した論文であり、核酸類似化合物と呼ばれる範疇の化合物がどのような作用機序で抗がん作用や変異原性を細胞のなかで発揮するかを包括的に解析するバイオアッセイを構築した報告である。以上の論文発表の事実から、本研究課題にそった研究内容で質の高い業績をあげた、と自己評価する。

Strategy for Future Research Activity

Top2による病的DNA２重鎖切断発生について、以下の研究を遂行する：（１）Top2が原因のDNA２重鎖切断の、BRCA1による修復
BRCA1は、相同DNA組換えによるDNA２重鎖切断修復に重要である。BRCA1の機能低下は、女性臓器（乳腺と卵巣）のみで発がんの原因になる。女性臓器特異的発がんの理由は不明であった。性ホルモンによる遺伝子転写調節にTop2βが関与するという知見（Nat Genet. 46: 516-21, 2014）にヒントを得て、BRCA1が相同DNA組換え以外の機能、Top2βによる病的DNA２重鎖切断を修復する機能を持つという仮説を立てた。我々は、MCF-7乳がん細胞株からBRCA1欠損細胞とTop2β欠損細胞を創り、この仮説が正しいことを証明した。この知見をH29年度に論文にまとめる。
（２）Top2βに働きかけてDNA２重鎖切断を誘導する環境ホルモンを検出するバイオアッセイの構築
我々は、MCF-7乳がん細胞株（野生型、BRCA1欠損、Top2β欠損）を使い、環境ホルモンのDNA毒性を検出するバイオアッセイを構築した。このバイオアッセイの妥当性を、米国National Toxicology Programの分担研究者であるDr. Xia Menghang（NIH）と共同して検証する研究を開始する。Dr. Xia Menghangは培養細胞におけるDNA２重鎖切断出現をハイスループットに検出する実験系と様々な環境ホルモン試料とをもつ。
（３）Top2に働きかけてDNA２重鎖切断を誘導する有害化学物質を予測するケモインフォマティクス手法の開発
市販抗がん治療薬の中に、Top2に働きかけてDNA２重鎖切断を誘導するTop2阻害剤がある。過去に製薬会社が実施したTop2阻害剤のスクリーニングのビッグデータを学習データに使い、開発目標を達成する。

Research Products

• [Int'l Joint Research] National Intsitutes of Health/ボストン大学/ノースカロライナ大学(米国)
  • Country Name: U.S.A.
  • Counterpart Institution: National Intsitutes of Health/ボストン大学/ノースカロライナ大学
  • # of Other Institutions: 1
• [Int'l Joint Research] ケンブリッジ大学内のMRC 分子生物学研究所/サセックス大学/レスター大学(英国)
  • Country Name: UNITED KINGDOM
  • Counterpart Institution: ケンブリッジ大学内のMRC 分子生物学研究所/サセックス大学/レスター大学
• [Journal Article] The dominant role of proofreading exonuclease activety of replicative polymerase ε in cellular tolerance to cytarabine (Ara-C). (2017)
  • Author(s): Tsuda M, Terada K, Ooka M, Kobayashi K, Sasanuma H, Fujisawa R, Tsurimoto T, Yamamoto J, Iwai S, Kadoda K, Akagawa R, Huang SN, Pommier Y, Sale JE, Takeda S, Hirota K
  • Journal Title: Oncotarget Volume: 8 Pages: 33457-33474
  • DOI: 10.18632/oncotarget.16508
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Cytotoxicity of tirapazamine (3-amino-1, 2, 4- benzotriazine-1, 4-dioxide)-induced DNA damage in chicken DT40 cells. (2017)
  • Author(s): Moriwaki T, Okamoto S, Sasanuma H, Nagasawa H, Takeda S, Masunaga S, Tano K
  • Journal Title: Chem Res Toxicol. Volume: 30 Pages: 699-704
  • DOI: 10.1021/acs.chemrestox.6b00417
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Active learning for computational chemogenomics. (2017)
  • Author(s): Reker D, Schneider P, Schneider G, Brown JB
  • Journal Title: Future Med Chem. Volume: 9 Pages: 381-402
  • DOI: 10.4155/fmc-2016-0197
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Human CTF18-RFC clamp-loader complexed with non-synthesising DNA polymerase ε efficiently loads the PCNA sliding clamp. (2017)
  • Author(s): Fujisawa R, Ohashi E, Hirota K, Tsurimoto T
  • Journal Title: Nucleic Acids Res. Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
  • DOI: 10.1093/nar/gkx096
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Homologous Recombination and Translesion DNA Synthesis Play Critical Roles on Tolerating DNA Damage Caused by Trace Levels of Hexavalent Chromium. (2016)
  • Author(s): Tian X, Patel K, Ridpath JR, Chen Y, Zhou YH, Neo D, Clement J, Takata M, Takeda S, Sale J, Wright FA, Swenberg JA, Nakamura J
  • Journal Title: PLoS One Volume: 11 Pages: e0167503
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0167503
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Mre11 Is Essential for the Removal of Lethal Topoisomerase 2 Covalent Cleavage Complexes. (2016)
  • Author(s): Hoa NN, Shimizu T, Zhou ZW, Wang ZQ, Deshpande RA, Paull TT, Akter S, Tsuda M, Furuta R, Tsusui K, Takeda S, Sasanuma H
  • Journal Title: Mol Cell Volume: 64 Pages: 580-592
  • DOI: 10.1016/j.molcel.2016.10.011
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Determination of genotoxic potential by comparison of structurally related azo dyes using DNA repair-deficient DT40 mutant panels. (2016)
  • Author(s): Ooka M, Kobayashi K, Abe T, Akiyama K, Hada M, Takeda S, Hirota K
  • Journal Title: Chemosphere Volume: 164 Pages: 106-112
  • DOI: 10.1016/j.chemosphere
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] A High-Throughput Screen Identifies 2,9-Diazaspiro[5.5]Undecanes as Inducers of the Endoplasmic Reticulum Stress Response with Cytotoxic Activity in 3D Glioma Cell Models. (2016)
  • Author(s): Martinez NJ, Rai G, Yasgar A, Lea WA, Sun H, Wang Y, Luci DK, Yang SM, Nishihara K, Takeda S, Sagor M, Earnshaw I, Okada T, Mori K, Wilson K, Riggins GJ, Xia M, Grimaldi M, Jadhav A, Maloney DJ, Simeonov A
  • Journal Title: PLoS One Volume: 11 Pages: e0161486
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0161486
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Poor recognition of O6-isopropyl dG by MGMT triggers double strand break-mediated cell death and micronucleus induction in FANC-deficient cells. (2016)
  • Author(s): Hashimoto K, Sharma V, Sasanuma H, Tian X, Takata M, Takeda S, Swenberg JA, Nakamura J
  • Journal Title: Oncotarget Volume: 7 Pages: 59795-59808
  • DOI: 10.18632/oncotarget.10928
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] The role of the Mre11-Rad50-Nbs1 complex in double-strand break repair-facts and myths. (2016)
  • Author(s): Takeda S, Hoa NN, Sasanuma H
  • Journal Title: J Radiat Res. Volume: 57 Suppl 1 Pages: i25-i32
  • DOI: 10.1093/jrr/rrw034
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Proteomics analysis with a nano Random Forest approach reveals novel functional interactions regulated by SMC complexes on mitotic chromosomes. (2016)
  • Author(s): Ohta S, Montano-Gutierrez LF, Alves FL, Ogawa H, Toramoto I, Sato N, Morrison CG, Takeda S, Hudson DF, Rappsilber J, Earnshaw WC
  • Journal Title: Mol Cell Proteomics Volume: 15 Pages: 2802-2818
  • DOI: 10.1074/mcp.M116.057885
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Repriming by PrimPol is critical for DNA replication restart downstream of lesions and chain-terminating nucleosides. (2016)
  • Author(s): Kobayashi K, Guilliam TA, Tsuda M, Yamamoto J, Bailey LJ, Iwai S, Takeda S, Doherty AJ, Hirota K
  • Journal Title: Cell Cycle Volume: 15 Pages: 1997-2008
  • DOI: 10.1080/15384101.2016.1191711
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] In vivo evidence for translesion synthesis by the replicative DNA polymerase δ. (2016)
  • Author(s): Hirota K, Tsuda M, Mohiuddin, Tsurimoto T, Cohen IS, Livneh Z, Kobayashi K, Narita T, Nishihara K, Murai J, Iwai S, Guilbaud G, Sale JE, Takeda T
  • Journal Title: Nucleic Acids Res. Volume: 44 Pages: 7242-7250
  • DOI: 10.1093/nar/gkw439
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Deazaflavin Inhibitors of Tyrosyl-DNA Phosphodiesterase 2 (TDP2) Specific for the Human Enzyme and Active against Cellular TDP2. (2016)
  • Author(s): Marchand C, Abdelmalak M, Kankanala J, Huang SY, Kiselev E, Fesen K, Kurahashi K, Sasanuma H, Takeda S, Aihara H, Wang Z, Pommier Y
  • Journal Title: ACS Chem Biol. Volume: 11 Pages: 1925-1933
  • DOI: 10.1021/acschembio.5b01047
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Oxidative stress at low levels can induce clustered DNA lesions leading to NHEJ mediated mutations. (2016)
  • Author(s): Sharma V, Collins LB, Chen TH, Herr N, Takeda S, Sun W, Swenberg JA, Nakamura J
  • Journal Title: Oncotarget Volume: 7 Pages: 25377-25390
  • DOI: 10.18632/oncotarget.8298
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] The role of HERC2 and RNF8 ubiquitin E3 ligases in the promotion of translesion DNA synthesis in the chicken DT40 cell line. (2016)
  • Author(s): Mohiuddin, Kobayashi S, Keka IS, Guilbaud G, Sale J, Narita T, Abdel-Aziz HI, Wang X, Ogawa S, Sasanuma H, Chiu R, Oestergaard VH, Lisby M, Takeda S
  • Journal Title: DNA Repair (Amst) Volume: 40 Pages: 67-76
  • DOI: 10.1016/j.dnarep.2016.02.002
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Chemical Incorporation of Chain-Terminating Nucleoside Analogs as 3'-Blocking DNA Damage and Their Removal by Human ERCC1-XPF Endonuclease. (2016)
  • Author(s): Yamamoto J, Takahata C, Kuraoka I, Hirota K, Iwai S
  • Journal Title: Molecules Volume: 21 Pages: E766
  • DOI: 10.3390/molecules21060766
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Local potentiation of stress-responsive genes by upstream noncoding transcription. (2016)
  • Author(s): Takemata N, Oda A, Yamada T, Galipon J, Miyoshi T, Suzuki Y, Sugano S, Hoffman CS, Hirota K, Ohta K
  • Journal Title: Nucleic Acids Res. Volume: 44 Pages: 5174-5189
  • DOI: 10.1093/nar/gkw142
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Mutator phenotype and DNA double-strand break repair in BLM helicase-deficient human cells. (2016)
  • Author(s): Suzuki T, Yasui M, Honma M
  • Journal Title: Mol Cell Biol. Volume: 36 Pages: 2877-2889
  • DOI: 10.1128/MCB.00443-16
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Impact of Ribonucleotide Backbone on Translesion Synthesis and Repair of 7,8-Dihydro-8-oxoguanine. (2016)
  • Author(s): Sassa A, Caglayan M, Rodriguez Y, Beard WA, Wilson SH, Nohmi T, Honma M, Yasui M
  • Journal Title: J Biol Chem. Volume: 291 Pages: 24314-24323
  • DOI: 10.1074/jbc.M116.738732
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Presentation] Mre11 Is Essential for the Removal of Lethal Topoisomerase 2 Covalent Cleavage Complexes (2017)
  • Author(s): Takeda S, Sasanuma H
  • Organizer: ATW2017 Ataxia-Telangiectasia Workshop
  • Place of Presentation: ミラノ（イタリア）
  • Year and Date: 2017-03-20 – 2017-03-24
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] SUMO化蛋白質を認識するRING型ユビキチンリガーゼRNF4による染色体恒常性維持機構の解明 (2017)
  • Author(s): 廣田耕志
  • Organizer: ヒストンバリアント研究会
  • Place of Presentation: 東北大学（宮城県・仙台市）
  • Year and Date: 2017-02-11 – 2017-02-11
  • Invited
• [Presentation] SUMO化蛋白質を認識するRING型ユビキチンリガーゼRNF4による、スピンドルアセンブリチェックポイント(SAC)活性維持と染色体ロスの防止 (2017)
  • Author(s): 廣田耕志、高木季代、津田雅貴、村井純子、Keka Islam, 成田岳雄、藤田真梨、笹沼博之、小林純也、武田俊一
  • Organizer: SUMO研究会
  • Place of Presentation: 関西学院大学（大阪府・大阪市）
  • Year and Date: 2017-01-22 – 2017-01-23
  • Invited
• [Presentation] DNA中の酸化リボヌクレオチドがDNA複製および修復機構に及ぼす影響 (2016)
  • Author(s): 佐々彰，Caglayan M, Beard WA, Wilson SH, 能美健彦，本間正充，安井学
  • Organizer: 第45回日本環境変異原学会
  • Place of Presentation: つくば国際会議場（茨城県・つくば市）
  • Year and Date: 2016-11-17 – 2016-11-18
• [Presentation] In vivo evidence for translesion synthesis by the replicative DNA polymeraseδ (2016)
  • Author(s): Hirota K, Tsuda M, Sale J, Takeda S
  • Organizer: The 10th 3R Symposium
  • Place of Presentation: ホテル一畑（島根県・松江市）
  • Year and Date: 2016-11-13 – 2016-11-17
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Ctf18-RFC bound to Polεloads PCNA efficiently (2016)
  • Author(s): Fujisawa R, Ohashi E, Hirota K, Tsurimoto T
  • Organizer: The 10th 3R Symposium
  • Place of Presentation: ホテル一畑（島根県・松江市）
  • Year and Date: 2016-11-13 – 2016-11-17
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Determination of genotoxic potential by comparison of structurally related azo dyes using DNA repair-deficient DT40 mutant panels (2016)
  • Author(s): Ooka M, Kobayashi K, Abe T, Akiyama K, Hada M, Takeda S, Hirota K
  • Organizer: The 10th 3R Symposium
  • Place of Presentation: ホテル一畑（島根県・松江市）
  • Year and Date: 2016-11-13 – 2016-11-17
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] The proofreading exonuclease activity of replicative polymerase ε contributes to cellular tolerance of cytarabine(Ara-C) (2016)
  • Author(s): Tsuda M, Takeda S, Hirota K
  • Organizer: The 10th 3R Symposium
  • Place of Presentation: ホテル一畑（島根県・松江市）
  • Year and Date: 2016-11-13 – 2016-11-17
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Elucidation of the chromatin reconstitution mechanism during transcriptional repression of Schizosaccharomyces pombe fdp1 (2016)
  • Author(s): Umeda M, Hirota K
  • Organizer: The 10th 3R Symposium
  • Place of Presentation: ホテル一畑（島根県・松江市）
  • Year and Date: 2016-11-13 – 2016-11-17
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Chromatin determinants of the inner-centromera rely on replication factors with functions that impart cohesion (2016)
  • Author(s): Abe T, Branzei D, Kawasumi R
  • Organizer: The 10th 3R Symposium
  • Place of Presentation: ホテル一畑（島根県・松江市）
  • Year and Date: 2016-11-13 – 2016-11-17
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Essential role of the Mre11-Rad50-Nbs1 complex in preventing the endogenous accumulation of lethal Topoisomerase2-DNA-cleavage complex (2016)
  • Author(s): Takeda S
  • Organizer: The 6th International Conference on Biomedical and Environmental Sciences & Technology, The 7th International Symposium on DNA Damage Response & Human Disease
  • Place of Presentation: 成都（中国）
  • Year and Date: 2016-10-14 – 2016-10-17
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] In vivo evidence for translation synthesis by the replicative DNA polymerase delta (2016)
  • Author(s): Hirota K, Tsuda M, Sale J, Takeda S
  • Organizer: DNA Polymerases Meeting
  • Place of Presentation: ビアリッツ（フランス）
  • Year and Date: 2016-10-04 – 2016-10-08
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] The Proofreading Exonuclease Activity of Replicative Polymerasee significantly Contributes to Elimination of Cytarabine (Ara-C) (2016)
  • Author(s): Tsuda M, Takeda S, Hirota K
  • Organizer: DNA Polymerases Meeting
  • Place of Presentation: ビアリッツ（フランス）
  • Year and Date: 2016-10-04 – 2016-10-08
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Mre11 Is Essential for the Removal of Lethal Topoisomerase 2 Covalent Cleavage Complexes (2016)
  • Author(s): Takeda S
  • Organizer: Genomic Instability, Gordon Research Conference
  • Place of Presentation: 香港（中国）
  • Year and Date: 2016-07-24 – 2016-07-29
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Remarks] 京都大学 プレスリリース（日本語）
  • URL: http://www.kyoto-u.ac.jp/ja/research/research_results/2016/170306_1.html
• [Remarks] 京都大学 プレスリリース（英語）
  • URL: http://www.kyoto-u.ac.jp/en/research/research_results/2016/170306_1.htm
• [Remarks] 日本経済新聞 プレスリリース
  • URL: http://www.nikkei.com/article/DGXLRSP438913_Y7A300C1000000/
• [Remarks] 京都新聞 掲載記事
  • URL: http://www.kyoto-np.co.jp/education/article/20170306000124
• [Remarks] マイナビニュース 掲載記事
  • URL: http://news.mynavi.jp/news/2017/03/09/238/