2019 Fiscal Year Annual Research Report
Establishment of Novel Bioassays for in vivo Genotoxicity Prediction and Mechanism Characterization
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16H06306
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
武田 俊一 京都大学, 医学研究科, 教授 (60188191)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
笹沼 博之 京都大学, 医学研究科, 准教授 (00531691)
Brown John 京都大学, 医学研究科, 講師 (90583188)
廣田 耕志 首都大学東京, 理学研究科, 教授 (00342840)
安井 学 国立医薬品食品衛生研究所, 変異遺伝部, 室長 (50435707)
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| Project Period (FY) |
2016-05-31 – 2021-03-31
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| Keywords | トキシコロジー / 人体有害物質 / 遺伝毒物学 / 発がん物質 / 変異原 / TK6細胞 / ケモインフォマティクス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の第一の目的は、化学物質審査規制法（化審法）で規定された変異原性検出試験の感度を改善し、世界標準の変異原性検出試験法を樹立することにある。感度改善は、ヒトTK6細胞（OECDガイドラインと化審法で推奨）由来の、DNA修復酵素欠損株を作製・利用して達成する。第二の研究目的は、変異原性の作用機序を迅速に分類分けする手法を創ることにある。分類分けは、in silico の変異原性検出手法の開発に貢献する。第三に、in silico の変異原性検出手法の手法を開発する。最後に、我々がDNA修復酵素欠損株を使って発見した、DNA毒性・変異原性の新たな作用機序を解明する。
我々は、TK変異試験（化審法に規定）の感度を５倍上られるDNA修復酵素欠損TK6株を創った（Ibrahim MA et al., 2020）。感度を上昇させることができるTK6株を創るだけでなく、化審法に規定された手法を使い、作用機序を迅速に分類分けできるTK6株も創った（TK6コンソーシアムのwebサイトに公開）。in silico の変異原性検出手法の開発した（Polash AH. Et al., 2019; Nakano T. et al., 2020）。DNA毒性・変異原性の新たな作用機序を解明することについては、以下の成果があった。リボヌクレオチド（RNA合成の基質）が間違ってDNAに取込まれた時に、ヌクレオチド除去修復がそのリボヌクレオチドをDNAから除去することを発見した（Sassa A et al., 2019）。電離放射線照射はゲノムを切断しかつその切断端には多様な化学修飾ができる。この化学修飾を除去する酵素群を同定した（Akagawa R. et al., 2020）。また男性ホルモンの前立腺に対する強いDNA毒性を発見した（Mahmud RA. et al., 2020）。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
4つの理由を以下に説明する。
1) 我々は、xpa/xrcc1 二重破壊TK6株を創り（Ibrahim MA et al., 2020）、そして菌を使うエイムス試験では陽性を示すが、哺乳類細胞を用いる変異原性検出試験では陰性を示す、従来、変異原性偽陽性と一応説明されてきた化学物質の変異原性を証明した。本研究の意義は以下の通りである。行政や化学産業のニーズは、AIにより新規化合物の化学構造から変異原性を予測することである。この予測（QSARと呼ばれる）実現には、質の高い学習データが必要である。AIの学習データには本間正充博士（分担研究者の安井博士の直接の上司）が収集したエイムス試験の結果（~20,000化合物）が全世界で使われている。二重破壊TK6株を使ったTK試験により「従来、変異原性偽陽性と一応説明されてきた化学物質」が変異原性陽性であることが証明できた。この成果は、全世界で使われるQSARの性能向上に貢献する。
2) in silico の変異原性検出手法について2報論文発表した。
3) DNA二重鎖切断は、放射線被曝で生じ、発がん性が非常に強い。我々は、DNA切断が自然発生する機序を見つけた。このDNA切断を再結合するDNA修復酵素の欠損株を作った。この欠損株を使い、生理濃度の女性ホルモンや男性ホルモン、環境ホルモン（例、ビスフェノール）が高いDNA切断活性を持つことを発見した。
4) 紫外線やシスプラチン（抗癌剤）で生じる損傷は、従来、ヌクレオチド除去修復（NER）のみが修復すると考えされてきた。そしてNERはミトコンドリアで機能しないが故に、紫外線損傷やシスプラチン損傷はミトコンドリアDNAから除去されないと考えされてきた。我々は、この定説を覆し、まず染色体DNAの紫外線損傷がNER以外の経路によって修復されることを論文発表した（2020年4月にPNAS USAに採択）。
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| Strategy for Future Research Activity |
（１）従来、変異原性偽陽性と一応説明されてきた化合物（オーラミンとパラフェニレンジアミン）の、ヒト細胞における変異原性を証明し論文発表する。
（２）我々が発見した、ミトコンドリアDNA（mtDNA）に生じたUV損傷を修復する経路を論文発表する。
（３）我々が発見した、染色体DNAとmtDNAに生じたシスプラチン損傷を修復する経路について論文発表する。mtDNAの修復には、ミトコンドリア特異的DNA Topoisomerase I (TOP1MT) が関与していた。既知のmtDNA修復因子はすべて細胞核でも機能しているが、TOP1MTはmtDNAでのみ機能する、唯一の修復因子である。一方、NERは細胞核でのみ機能する。TOP1MT欠損マウスとNER欠損マウスを既に取得済みである。これらの欠損マウスの表現型をシスプラチン曝露後に比較することによって、mtDNAのみに損傷が蓄積する影響を、染色体DNAのみに損傷が蓄積する影響から区別しながら、解析できる動物実験系を世界で初めて樹立できる。この成果を論文発表する。予備実験から、TOP1MTが欠損するとシスプラチンの急性腎毒性が強く顕れることを既に確認した。
（４）男性ホルモンの変異原性を解析する動物実験系を樹立した（Mahmud RA. et al., 2020）。この研究を発展させ、この変異原性による発癌機序を解析する動物実験系を樹立し、性ホルモンによる乳腺、卵巣、前立腺の発癌機序を解明する。実験手法は、変異原性を高めるATM酵素阻害剤と性ホルモンとを毎日３０日間腹腔注射することである。そして３０日後に乳腺、卵巣、前立腺において癌を多発させることを目指す。
（５）様々な環境ホルモンの変異原性をハイスループットに検出する共同研究を、米国NIHの研究者（Dr. Xia Menghang）と実施している。この研究成果を発表する。
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