2020 Fiscal Year Annual Research Report
Microfluidic approach to single cell transcriptome analysis and its applications
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16H06328
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
藤井 輝夫 東京大学, 生産技術研究所, 教授 (30251474)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
長阪 一憲 帝京大学, 医学部, 教授 (30624233)
PLESSY Charles 沖縄科学技術大学院大学, ゲノム・遺伝子制御システム科学ユニット, グループリーダー (60391984)
Kim SooHyeon 東京大学, 生産技術研究所, 講師 (80709189)
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| Project Period (FY) |
2016-05-31 – 2021-03-31
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| Keywords | 単一細胞解析 / トランスクリプトーム解析 / 誘電泳動 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
令和２年度では、picoCAGEの反応条件を網羅的に検討するため、Labcyte Echo 525 を利用して様々な濃度のRTプライマーとTSオリゴとを用いた反応効率と、逆転写酵素であるSuperScript III (SS III)とSuperScript IV (SS IV)の反応効率の検討も行った。検討の結果、1細胞からのRNAを解析するためにはSS IVを用いた反応が適切であることを確認した。これにより、picoCAGEの反応を用いて単一細胞からのRNAからCAGE解析が可能であることを確認した。
さらに、RNAの全ての配列を解析するため、Oxford Nanopore MinIONシーケンサーを用いたpicoCAGE方法を確立した。具体的には、RTプライマーとTSオリゴにNanoporeの標準配列を導入し、Labcyte Echoを用いて反応条件の検討による最適化することで、picoCAGE方法を確立した。picoCAGEのベンチマーク実験のため、すでにその濃度と長さが分かっているExternal RNA Controls Consortium（ERCC）スパイクイン合成RNAコントロールを用いてシーケンスライブラリーを生成し、Oxford Nanopore MinIONシーケンサーで解析した結果、ERCC合成コントロールによる良好な検出感度、良好なアライメント精度（～85％）、満足できる総検出遺伝子数（7000～14000個）などが確認できた。最後に、単一細胞（マウス3T3細胞29個、ヒトCAPAN-2細胞54個＋ERCCスパイク5%）から得られた83個のバーコード付き逆転写産物のプールから調製したpicoCAGEライブラリーのシーケンスに成功した。
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| Research Progress Status |
令和2年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和2年度が最終年度であるため、記入しない。
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Research Products
(7 results)
