2017 Fiscal Year Annual Research Report
Development of the RNAi screening system for apicobasal polarity factors
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16H07014
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
本田 尚三 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(医学系), 助教 (50778206)
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| Project Period (FY) |
2016-08-26 – 2018-03-31
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| Keywords | 上皮細胞 / 上皮極性 / RNAi / ゲノムワイドスクリーニング / 画像解析 / ZO-1 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
多細胞生物の生存に必須である上皮極性形成の分子メカニズムを解明するために、RNAiによる上皮極性関連分子の網羅的スクリーニング法の開発を行った。大規模なスクリーニングを行う場合、実験手技による再現性や、プレートのウェル間のばらつきが問題になるので、再現性と感度の高い検出アルゴリズムを構築する必要がある。そこで、コントロールとZO-1リングが縮小する変化を示すCDC42, PARD3, PARD6B, PRKCZ、拡大するLLGL2をそれぞれ８ウェルずつノックダウンし、ZO-1の免疫蛍光染色を行い、スクリーニング系の妥当性を評価する指標であるZ´-factorを算出することで評価した。まず一細胞ごとのZO-1シグナルの面積を算出したところ、縮小型において高い検出力を示した。一方で拡大型は検出不能であったが、核領域と重なるZO-1シグナルのみを算出したところ、拡大型が検出可能となった。さらに、同時に検出した核領域以外のZO-1シグナルとの比を算出すれば、拡大型と縮小型の区別が可能になった。よって、縮小型、拡大型ともに検出力のあるスクリーニング系の構築が完了した。本スクリーニングを行うため、384ウェルプレートを用いて、自動分注機と自動洗浄機による細胞播種、免疫蛍光染色を行い、適切な染色方法を検討した。その後、18,152遺伝子に対するsiRNAが分注されたsiRNAライブラリー（計70プレート）を用いて、本スクリーニングを実行した。本研究課題によって、上皮極性形成システム構成因子の網羅的スクリーニングデータを取得することができた。
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| Research Progress Status |
29年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
29年度が最終年度であるため、記入しない。
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