Molecular mechanisms underlying sterile inflammation in acute lung injury

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16H07151
• Research Institution: Jichi Medical University
• Principal Investigator: 水品 佳子 自治医科大学, 医学部, 助教 (70458321)
• Project Period (FY): 2016-08-26 – 2018-03-31
• Keywords: 炎症 / 酵素 / 細胞・組織 / 肺疾患 / 免疫学

Outline of Annual Research Achievements

酸刺激で誘導されるカスパーゼ-1非依存的な新規IL-1βプロセシング機構を解明する目的を達成するため、in vitroで解析を行った。IL-1β前駆体はカスパーゼ-1によって17-kDaの成熟型IL-1βにプロセシングされるが、THP-1細胞をpH 1.75酸性溶液で刺激すると、20-kDaの成熟型IL-1β（以下p20-IL-1β）がプロセシングされた。そこでp20-IL-1βのプロセシングに関わる責任プロテアーゼを同定するため、まずは各種プロテアーゼ阻害剤を用いて解析を行った。p20-IL-1βのプロセシングはセリンプロテアーゼ阻害剤であるAEBSFでは抑制され、システインプロテアーゼ阻害剤であるE64は抑制されなかった。このことからセリンプロテアーゼがp20-IL-1βのプロセシングに関与していることが示唆されたが、THP-1細胞に発現が報告されているセリンプロテアーゼの1つであるカテプシンGの阻害剤ではプロセシングは抑制されず、プロテアーゼ阻害剤による解析ではこれ以上の同定を行うことは困難であった。
次に既知のIL-1βのプロセシング部位のアミノ酸配列に変異を導入したIL-1β（Y113D、V114E、D116I）をTHP-1細胞に導入し解析を行ったが、いずれの変異体もp20-IL-1βのプロセシングは抑制されなかった。
そこで、プロセシングされたIL-1βを質量分析し、アミノ酸の切断部位を同定することを試みた。まず初めにFlag-tag・His-tag付きIL-1βをTHP-1細胞に導入し、酸刺激を添加して、大量のTHP-1培養上清を作製した。それを限外ろ過カラム、Niアガロースビーズおよび抗Flag抗体アフィニティーゲルを用いて精製後に抽出し、現在質量分析で解析中である。

Research Progress Status

29年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

29年度が最終年度であるため、記入しない。