2017 Fiscal Year Annual Research Report

A new regulatory mechanism of the yeast amino acid permease by phosphorylation

Research Project

Project/Area Number	16H07162
Research Institution	Aoyama Gakuin University
Principal Investigator	望月貴博青山学院大学, 理工学部, 助教 (40783387)
Project Period (FY)	2016-08-26 – 2018-03-31
Keywords	Saccharomyces cerevisiae / 低親和性トリプトファン輸送体Tat1 / リン酸化 / アレスチン様タンパク質
Outline of Annual Research Achievements	本研究では、様々なアミノ酸輸送体の多様な基質特異性と分解の制御機構を明らかにするため、出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeの低親和性トリプトファン輸送体Tat1を用いて、リン酸化がアミノ酸輸送体を制御しているのか調べた。昨年度に続き、質量分析によってTat1のリン酸化部位を同定するため、Tat1のN末端側にGSTタグを融合させ、グルタチオンカラムを用いて大量精製を試みた。細胞数を増やし、様々な界面活性剤を用いるなど精製方法を検討したが、質量分析を行うには不十分な量のTat1しか精製できなかった。そこで、リン酸化すると予想された部位をアラニン置換したTat1のN末端側細胞質ドメイン発現プラスミドを用いてリン酸化バンドの検出を行なった。その結果、リン酸化されている部位を明らかにすることができた。 Tat1のリン酸化と分解制御の関係性を明らかにするため、まずTat1とTat1の分解を担うと考えられているアレスチン様タンパク質の相互作用をイーストツーハイブリッドシステムによって調べた。その結果、Tat1とアレスチン様タンパク質Art3、Art4とBul2がTat1と相互作用することが明らかとなった。しかし、昨年度明らかにしたTat1のリン酸化を担っているキナーゼYck1、Yck2とKns1はTat1と相互作用していなかった。すなわち、Yck1、Yck2とKns1はTat1のリン酸化を間接的に担っており、直接Tat1をリン酸化するキナーゼは他に存在していることが考えられた。これまでの研究により、N末端側細胞質ドメインのリン酸化が輸送体の分解を制御していることがわかったが、実際にTat1のリン酸化部位をアレスチン様タンパク質が認識しているのか調べる必要がある。また、ヒトの輸送体もリン酸化されており、分解が制御されているのか検討することが望まれる。
Research Progress Status	29年度が最終年度であるため、記入しない。
Strategy for Future Research Activity	29年度が最終年度であるため、記入しない。