新規発光膜電位センサーを用いたマウスの運動指令形成メカニズム解明

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16J00111
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 稲垣 成矩 大阪大学, 生命機能研究科, 特別研究員(DC2)
• Project Period (FY): 2016-04-22 – 2018-03-31
• Keywords: 化学発光タンパク質 / 膜電位指示薬 / イメージング / 自由行動 / 脳活動計測 / 光遺伝学ツール / ドラッグスクリーニング

Outline of Annual Research Achievements

報告者は、化学（生物）発光タンパク質と蛍光タンパク質を膜電位感受性ドメインに繋げる事で、世界初の化学発光膜電位指示薬、LOTUS-V（Luminescent Optical Tool for Universal Sensing of Voltage）を開発する事に成功した。そして光照射で細胞の膜電位を制御する事が可能な光遺伝学ツールを用いた実験と、LOTUS-Vを用いた膜電位イメージングを共に組み合わせる事が可能である事を証明した。またLOTUS-Vが、iPS細胞由来心筋細胞における長時間の薬剤評価実験に有用であることも証明した。蛍光指示薬を用いて上記の結果を再現する事は難しく、LOTUS-Vが神経科学と心臓科学の分野において非常に有用である事を示している。そして報告者は以上の結果をまとめ、論文を一報（Scientific Reports）総説論文も二報（Current Opinion In Chemical Biology, Drug Delivery System）発表してる。
上記の実験と並行して報告者は、自由行動中のマウスの発光イメージング法を確立し、これもScientific Reports誌に報告した。そしてこのシステムをLOTUS-V用に最適化し、自由行動下におけるマウスの視覚野の活動を計測する事に成功した。上記の結果は、自由行動中の動物における新規の脳活動計測法を開発した事を意味しており、光ファイバーを用いた計測よりも、シンプルな光学システムで脳活動を計測する事が可能である。よってマウスの社会的活動を計測する上で有用であり、神経科学の分野において非常にインパクトがある。そして報告者は多くの学会でこの結果について発表し、昨年度だけでポスター賞を3つ受賞した。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

報告者はアデノ随伴ウィルスを用いて、LOTUS-Vをマウスの第一運動野に発現させ、頭部固定下で発光イメージングを行った。結果として、トレッドミル上のマウスの移動速度と、第一運動野の活動には正の相関がある事が分かり、またマウスが運動する直前から、第一運動野の活性化が見られた。さらに報告者は、LOTUS-Vを用いた発光イメージングの特性を活かし、光ファイバーなしに、マウスの第一視覚野の活動を自由行動下で計測する事に成功した。そして暗箱中でマウスが移動するに伴い、第一視覚野の活動が上昇している事が明らかになった。以上の結果は、マウスの随意運動における脳の活動をLOTUS-Vを用いた発光イメージングで計測が可能である事を意味しており、非常に重要度が高い。また報告者が開発した自由行動下における脳活動計測法は、マウスに与えるストレスが少ないため、マウスの随意運動を妨げる可能性は極めて低いという利点がある。
また報告者はKENGE-tetシステムを利用し、ハウスキーピング遺伝子であるβアクチン遺伝子部位にLOTUS-VをtetOプロモーターと共にノックインしたマウスを作製した。そしてCaMKIIα-tTAマウスと交配を行い、興奮性神経細胞特異的にLOTUS-Vを高発現するマウスの作製に成功した。すでに脳の広範囲にわたって、LOTUS-Vからのシグナルが得られる事は、ex vivoの実験により確認済みである。よってこのマウスを実験に用いる事で、脳の広範囲の領域における脳活動計測が今後可能になる事が期待される。

Strategy for Future Research Activity

報告者はLOTUS-Vを用いて、マウスの運動野と視覚野における活動を計測する事に成功したが、さらに深部からの脳活動を計測するために、LOTUS-Vを赤色化する。現在、生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)ドナーとなる化学発光タンパク質と、BRETアクセプターとなる蛍光タンパク質の組み合わせを試しており、次年度はリンカー配列や蛍光タンパク質の異なる組み合わせを試すことで、赤色化した新規膜電位指示薬の開発を行う。そして大脳皮質表層の活動はLOTUS-V、深部は赤色化した化学発光膜電位指示薬を用いる事で、マウスの運動運動指令形成の過程を明らかにすることを目指す。

Research Products

• [Int'l Joint Research] University of Oxford(英国)
  • Country Name: UNITED KINGDOM
  • Counterpart Institution: University of Oxford
• [Int'l Joint Research] Ｅｍｏｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ(米国)
  • Country Name: U.S.A.
  • Counterpart Institution: Ｅｍｏｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
• [Journal Article] Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Angiogenesis in Flk1-Nano-lantern Transgenic Mice. (2017)
  • Author(s): Matsushita, J*., Inagaki, S*(equal contribution)., Nishie, T., Sakasai, T., Tanaka, J., Watanabe, C., Mizutani, K., Miwa, T., Matsumoto, K., Takara, K., Naito, H., Kidoya, H., Takakura, N., Nagai, T., Takahashi, S., Ema, M.
  • Journal Title: Scientific Reports. Volume: 印刷中
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Genetically encoded bioluminescent voltage indicator for multi-purpose use in wide range of bioimaging. (2017)
  • Author(s): Inagaki, S., Tsutsui, H., Suzuki, K., Agetsuma, M., Arai, Y., Jinno, Y., Bai, G., Daniels, M. J, Okamura, Y., Matsuda, T., Nagai, T.
  • Journal Title: Scientific Reports. Volume: 7, 42398
  • DOI: 10.1038/srep42398
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] An Investigation of Effect of Bioluminescent Light on Human using Electroencephalogram. (2016)
  • Author(s): Thammasan, N., Iwano, M., Moriyama, K., Fukui, K., Kawintiranon, K., Buatong, Y., Inagaki, S., Nagai, T., and Numao, M.
  • Journal Title: Proc. The 23nd International Display Workshop in conjunction with Asia Display Volume: なし Pages: 57-60
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Current progress in genetically encoded voltage indicators for neural activity recording (2016)
  • Author(s): Inagaki, S., Nagai, T.
  • Journal Title: Current Opinion In Chemical Biology Volume: 33 Pages: 95-100
  • DOI: 10.1016/j.cbpa.2016.05.023
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 遺伝子にコードされた膜電位センサーによる神経活動計測の現状と展望 (2016)
  • Author(s): 稲垣成矩、永井健治
  • Journal Title: Drug Delivery System Volume: 31-2 Pages: 119-126
  • DOI: http://doi.org/10.2745/dds.31.119
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Chemiluminescent voltage indicator applicable to brain activity recording in freely moving mice (2017)
  • Author(s): Inagaki, S., Agetsuma, M., Hidekazu, T., Ohara, S., Arai, Y., Suzuki, K., Jinno, Y., Matsuda, T., Iijima, T., Okamura, Y. Nagai, T.
  • Organizer: Humanware International Symposium 2017
  • Place of Presentation: Senri Hankyu Hotel
  • Year and Date: 2017-01-26
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Chemiluminescent voltage indicator applicable to brain activity recording in freely moving mice. (2016)
  • Author(s): 1.Inagaki, S., Agetsuma, M., Hidekazu, T., Ohara, S., Arai, Y., Suzuki, K., Jinno, Y., Matsuda, T., Iijima, T., Okamura, Y. Nagai, T.
  • Organizer: The 20th ISIR International Symposium
  • Place of Presentation: Knowledge Capital Congrès Convention Center
  • Year and Date: 2016-12-12 – 2016-12-13
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 自由行動マウスの脳活動計測を可能にする化学発光膜電位センサーの開発 (2016)
  • Author(s): 稲垣成矩・揚妻正和・筒井秀和・新井由之・鈴木和志・神野有香・岡村康司・松田知己・永井健治
  • Organizer: 第39回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜
  • Year and Date: 2016-11-30 – 2016-12-01
• [Presentation] 自由行動マウスの脳活動計測を可能にする化学発光膜電位センサーの開発 (2016)
  • Author(s): 稲垣成矩・揚妻正和・筒井秀和・新井由之・鈴木和志・神野有香・岡村康司・松田知己・永井健治
  • Organizer: 第54回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: つくば国際会議場
  • Year and Date: 2016-11-25 – 2016-11-27
• [Presentation] Development of a chemiluminescent voltage indicator applicable to brain activity recording in freely moving mice (2016)
  • Author(s): Shigenori Inagaki, Masakazu Agetsuma, Tsutsui Hidekazu, Yoshiyuki Arai, Kazushi Suzuki, Yuka Jinno, Yasushi Okamura, Tomoki Matsuda and Takeharu Nagai
  • Organizer: QBiC Symposium 2016 Decoding Organisms by Quantitative Cell Profiling
  • Place of Presentation: Senri Life Science Center
  • Year and Date: 2016-09-05 – 2016-09-07
• [Presentation] 自由行動マウスの脳活動計測を可能にする化学発光膜電位センサーの開発 (2016)
  • Author(s): 稲垣成矩
  • Organizer: 蛋白研セミナー「膜タンパク質の構造ダイナミクス」
  • Place of Presentation: 大阪大学蛋白質研究所
  • Year and Date: 2016-05-12 – 2016-05-13
  • Invited
• [Remarks] 永井研究室ホームページ
  • URL: http://www.sanken.osaka-u.ac.jp/labs/bse/index.html
• [Remarks] 大阪大学大学院生命機能研究科 研究成果
  • URL: http://www.fbs.osaka-u.ac.jp/jpn/events/achievement/inagaki-nagai-20170213/