2016 Fiscal Year Annual Research Report
環境浄化細菌の効率的制御を目指した細胞間コミュニケーションの実態解明
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16J00487
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
森永 花菜 筑波大学, 生命環境科学研究科, 特別研究員(DC1)
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2016-04-22 – 2019-03-31
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| Keywords | 細胞間コミュニケーション / 排水処理 / Paracoccus denitrificans |
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| Outline of Annual Research Achievements |
数百種の細菌から構成される複合微生物系である活性汚泥内で細胞間コミュニケーションを可視化する系を構築するため、まず、細胞間コミュニケーション検出株を作製した。細胞間コミュニケーション検出株の作製には、活性汚泥から頻繁に単離されるParacoccus denitrificansを用いることとした。まず、細胞間コミュニケーション制御下の遺伝子を同定する必要がある。そのため、野生株と細胞間コミュニケーション関連遺伝子欠損株の遺伝子の転写量を網羅的に解析するため、RNA-seqを用いて転写量の比較を行った。このうち発現量の変動が大きい遺伝子、さらには異種細菌由来の細胞間コミュニケーション制御下の遺伝子を用い、蛍光タンパク遺伝子と結合させることで、細胞間コミュニケーションの検出が可能であるかを検証した。この結果、ある1種類の遺伝子を用いた場合において、細胞間コミュニケーション物質に応答して蛍光することが確かめられた。今回作製した株を用いることで、活性汚泥内での細胞間コミュニケーションを可視化できることが考えられる。
また、複合微生物系内に外から細菌を導入すると、元々の細菌叢を崩してしまう可能性があるため、細胞間コミュニケーション検出株を導入した際の活性汚泥の菌叢の変化を確かめた。細胞間コミュニケーション検出株導入時と非導入時での菌叢を次世代シークエンサーによって解析したところ、ある一定量の細胞間コミュニケーション検出株導入時にも菌叢の変化は見られなかった。このことより、活性汚泥中に細胞間コミュニケーション検出株を導入し、細胞間コミュニケーションを検出する際にも、元々の菌叢を変化させることなく実環境を模した状態で、観察をすることが可能であることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度は、複合微生物系である活性汚泥内で細胞間コミュニケーションを可視化する系を構築するため、Paracoccus denitrificansを用いて細胞間コミュニケーション応答株を作製することを目的とした。まず、細胞間コミュニケーションシグナルに応答して転写量が変動する遺伝子の選抜を行った。続いて選抜した遺伝子の中で、実際に細胞間コミュニケーションシグナルに応答する遺伝子を選別するため、選抜遺伝子のプロモーターの下流に蛍光タンパクをコードする遺伝子を結合させ、P. denitrificansに導入した。作製した株に細胞間コミュニケーションシグナルを添加し、蛍光の有無を共焦点顕微鏡を用いることで確かめた。その結果、ある1種類の遺伝子を用いた際に蛍光することが確かめられた。このことより、細胞間コミュニケーション応答株の作製に成功したと言える。
また、活性汚泥中で細胞間コミュニケーション応答株の局在を可視化するためには、細胞間コミュニケーション応答時とは異なる色で常に蛍光していることが必要になる。そのため、RNA-seqの結果を用いて常発現の遺伝子を選別し、異なる色の蛍光タンパクをコードする遺伝子と結合させた後に、本遺伝子領域を、菌の形質を損なわないようなゲノム上の領域に導入した。その結果、常発現で蛍光する株を作製することに成功した。さらに、細胞間コミュニケーション応答株でも同様に、本遺伝子領域を導入することで、常発現で蛍光し尚且つ細胞間コミュニケーションシグナルに応答して蛍光する株の作製に成功した。このことより、活性汚泥中での細胞間コミュニケーション応答株の局在及び細胞間コミュニケーションシグナルへの応答が可視化可能となることが示唆された。今年度においては、計画通りの結果が得られたと考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度は、活性汚泥中に細胞間コミュニケーション応答株を任意の量定着させ、共焦点顕微鏡を用いて観察を行うことで、細胞間コミュニケーションが起こる条件を探る。画像解析ソフトIMARISを用いることで、活性汚泥全体の量、細胞間コミュニケーション応答株においてコミュニケーションをしている株、していない株の量を定量することが可能になる。本手法を用いて画像解析を行うことで、細胞間コミュニケーションを起こすために必要な菌体数の測定を行う。また、活性汚泥は現場ごとに菌叢が異なると考えられるため、導入した細胞間コミュニケーション応答株が細胞間コミュニケーションを行う条件も異なることが予想される。このため、異なる種類の活性汚泥においても、細胞間コミュニケーションが起こる条件を比較する。
本実験系には2点の問題が生じることが予想される。1つは、活性汚泥自体に自家蛍光が存在することである。このため、導入した細胞間コミュニケーション応答株が発する蛍光と自家蛍光を識別する必要が生じる。本問題に対しては、当研究室の所有する顕微鏡の、高感度ディテクター及び検出する波長の限定が可能という特性を生かして、各蛍光の識別が可能であるかを検証する。
また、2点目の問題としては、活性汚泥に外部から細菌を添加する際に、添加した細菌の定着率を制御することが困難であることである。今年度、P. denitrificansの細胞間コミュニケーションメカニズムの詳細解析を行った際に、P. denitrificansにおける付着因子を明らかにした。本遺伝子の破壊株、もしくは過剰発現株を用いることで、定着率の制御が可能になるかも検証し、活性汚泥へ細胞間コミュニケーション応答株を任意の量定着させることを目指す。
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[Journal Article] Membrane vesicle-mediated bacterial communication2017
Author(s)
Masanori Toyofuku, Kana Morinaga, Yohei Hashimoto, Jenny Uhl, Hiroko Shimamura, Hideki Inaba, Philippe Schmitt-Kopplin, Leo Eberl, Nobuhiko Nomura
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Journal Title
The ISME Journal
Volume: 13
Pages: -
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
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