2017 Fiscal Year Annual Research Report
植物レドックスシグナルの鍵となる活性酸素生成酵素の制御機構解明
| Project/Area Number |
16J00771
|
|---|
| Research Institution | The University of Tokyo |
|---|
Principal Investigator |
後藤 幸久 東京大学, 理学系研究科, 特別研究員(DC1)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2016-04-22 – 2019-03-31
|
| Keywords | 植物 / 活性酸素 / シグナル伝達 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、植物の免疫応答に関わるレドックスシグナル伝達経路を明らかにするため、活性酸素生成酵素RBOHDに着目し、その制御機構を明らかにする。
本年度は、活性酸素生成酵素RBOHD、及び病原菌由来物質 (PAMP) 受容体の1つであるEFR結合因子として単離した受容体型キナーゼ RBOHD-EFR Associated LRR-RLK1 (REAL1)のシロイヌナズナ遺伝子欠損変異体、及び過剰発現体を作出し、PAMP誘導性の活性酸素生成を含む免疫応答について調査した。その結果、real1遺伝子欠損変異体では、PAMP誘導性の1)活性酸素生成、2)Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK) 活性化、3)下流の遺伝子発現がそれぞれ亢進していた。一方でREAL1過剰発現体では、PAMP誘導性の1)活性酸素生成、2)MAPK活性化、3)下流の遺伝子発現がそれぞれ抑制されていた。現在は、real1遺伝子欠損変異体、及びREAL1過剰発現体の病原細菌に対する抵抗性を評価している。また、これら免疫応答の変化がどのようなメカニズムで生じているか明らかにするため、PAMP応答に関わるPAMP受容体複合体構成因子のタンパク質量を調査した。その結果、細菌の鞭毛タンパク質の受容体であるFLS2のタンパク質量が野生型と比べてreal1遺伝子欠損変異体では増加し、REAL1過剰発現体では減少していた。これらの結果は、REAL1がPAMP受容体のタンパク質量を調節することによって免疫応答を制御していることを示唆している。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画通り、シロイヌナズナのreal1遺伝子欠損変異体、及びREAL1過剰発現体を作出し、REAL1遺伝子発現の変化がPAMP誘導性の免疫応答に影響を及ぼすことを明らかにした。更に、PAMP受容体複合体構成因子のタンパク質量を調べたところ、REAL1の遺伝子発現変化によって細菌の鞭毛タンパク質の受容体であるFLS2のタンパク質量が変化することを明らかにした。当初の計画では、本年度にREAL1がRBOHDを含むどのPAMP受容体複合体構成因子と結合するか明らかにするため、酵母ツーハイブリット法、in vitro結合アッセイ、及び共免疫沈降を行う計画をしていたが、real1遺伝子欠損変異体やREAL1過剰発現体の表現型観察を優先したため、次年度に行う予定である。しかし、アッセイに必要なコンストラクトの作製やサンプルの調製は現在進行中であることから、今後、問題なく遂行できると考えている。
|
| Strategy for Future Research Activity |
今後は、REAL1がどのようにしてFLS2タンパク質量を制御しているのか明らかにする。初めに、既存のFLS2タンパク質輸送やタンパク質分解に関わる制御因子の阻害剤を処理し、real1遺伝子欠損変異体、及びREAL1過剰発現体でのFLS2タンパク質量を評価する。次に、REAL1遺伝子発現変化によるFLS2タンパク質動態への影響を評価するため、GFP蛍光タンパク質を付加したFLS2-GFPタンパク質を発現させたシロイヌナズナ形質転換体(pFLS2:gFLS2-GFP)に対して、real1遺伝子欠損変異体、及びREAL1過剰発現体をそれぞれ掛け合わせた系統を作出し、共焦点レーザー顕微鏡によってFLS2-GFPタンパク質の動態をリアルタイムで観察する。更に、REAL1がRBOHDを含むどのPAMP受容体複合体構成因子と結合するか明らかにするため、酵母ツーハイブリット法、in vitro結合アッセイ、及び共免疫沈降を行う。
|
