2017 Fiscal Year Annual Research Report
膜タンパク質機能を標的とした新規ペプチド創薬ｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング系構築
| Project/Area Number |
16J00901
|
|---|
| Research Institution | Osaka University |
|---|
Principal Investigator |
岡村 昂典 大阪大学, 工学研究科, 特別研究員(DC1)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2016-04-22 – 2019-03-31
|
| Keywords | 無細胞翻訳系 / リポソーム / リポソームディスプレイ法 / 人工デザイン膜タンパク質 / ポア形成機能 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、リポソームディスプレイ法を用いた膜タンパク質の輸送機能阻害剤の探索系確立を目指していた。具体的にはカルシウムイオンのトランスポーターLetm1をモデルにライブラリー化したペプチドの中から輸送機能活性の阻害作用を示す配列を取得する系の確立を目指していた。トランスポーターの機能活性を直接標的にした探索系はあまり報告されたことがなく、本研究の提案により新規のin vitroペプチド創薬の立ち上げが期待されていた。研究目標達成のマイルストーンとして、Letm1の既知の低分子阻害剤を用いた際、実際にLetm1の活性阻害が起こる、ということを挙げていた。しかし実際にはLetm1の活性を阻害することは出来ずマイルストーンの達成は困難だった。そこで、H29年度は研究の方向性を修正し、新しい膜タンパク質の機能測定系確立を目指した。
ターゲットにはポアを形成するよう人工的にデザインされた7h2Lを選定した。7h2Lは人間が特定の機能を発現するよう膜タンパク質配列をデザインする試みの一環で生み出された人工配列であり、タンパク質工学の世界最先端の成果である。これまでの研究において7h2Lの結晶構造は明らかにされてきた。一方で、そのポア形成能のために生細胞を用いた実験系では細胞自体が死滅してしまい機能アッセイ系の立ち上げが困難であるという制限があった。そこで本年度はリポソームディスプレイ法を用いて機能アッセイ系を確立することを試みた。具体的には7h2Lによるポア形成の有無を、リポソームの外部に添加した蛍光ビオチンの内部への集積によって判断する実験系をデザインした。結果、発現した7h2Lで天然のポア形成膜タンパク質αへモリシンと同様にバックグラウンドに対して有意に蛍光ビオチンがリポソームに集積する様子を観測できた。以上の結果から当初の計画とは異なるものの順調に研究が進展していると考えている。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
本研究では、Letm1をモデルにトランスポーターの輸送活性を阻害する分子をペプチドライブラリーから取得することを目指していた。そのためにはまず、既知の低分子阻害剤を用いることで発現したLetm1のリポソームへのカルシウムイオン取り込みを実際に阻害できることを示し、本実験系が阻害作用のある基質をスクリーニング可能であることを確かめる必要があった。しかし、当初の想定と異なり複数の低分子阻害剤や実験条件でリポソームへのカルシウム取り込みを阻害することができず上記マイルストーンの達成は困難であると判断した。従って研究の進捗は遅れていると考えている。
|
| Strategy for Future Research Activity |
研究計画の方向性を修正し、リポソームディスプレイ法を阻害剤探索系ではなく機能アッセイ系に利用する。今後は無細胞翻訳系を用いて合成した7h2Lの4次構造を高速液体クロマトグラフィーを用いて明らかにする予定である。また、7h2Lには相同性が高いのにポア形成機能活性の低い変異体C７がある。部位特異的にアミノ酸変異を入れた後、機能活性を比較することで配列機能相関について探ることも計画している。
|
Research Products
(1 results)
