2017 Fiscal Year Annual Research Report
翻訳伸長段階におけるリボソームストークタンパク質複合体の分子動態解析
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16J01001
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| Research Institution | Niigata University |
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Principal Investigator |
今井 大達 新潟大学, 大学院自然科学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2016-04-22 – 2019-03-31
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| Keywords | リボソーム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
リボソームストークタンパク質は、翻訳の開始・伸長・終結などの様々な過程で、GTP結合性翻訳因子をリボソーム機能中心へリクルートするが、その機構は未解明である。本研究では、ストークタンパク質の翻訳因子のリクルート機構を解明することを目的としている。本年度は以下の研究を実施した。
【リボソームの1粒子イメージング】
X線自由電子レーザーを用いて、リボソームの1粒子イメージングを行った。ストークタンパク質L12を特異的に除去した大腸菌コアリボソームに、標識L12を再構成したハイブリッドリボソームを調製した。SACLAにてXFEL回折実験を行い、ストークタンパク質由来の回折の取得に成功した。
【翻訳リサイクルにおけるストークタンパク質の機能解析】
翻訳を終えたリボソームは、ABCタンパク質ファミリーの一種、ABCE1により促進される。我々は平成28年度の研究において、ストークタンパク質がABCE1に直接結合し、ABCE1のリボソーム依存のATP加水分解活性を著しく上昇させることを見出した。平成29年度は、主にストークタンパク質P1とABCE1の相互作用様式を解明するため、大腸菌発現系で精製したABCE1とP1合成ペプチドを用いてX線結晶構造解析を試みた。結晶化条件のスクリーニングを行い、良質な結晶を得ることに成功した。回折データは、新潟大学付属のX線回折装置を用いて取得した。その後、ABCE1・P1ペプチド複合体の立体構造モデルを決定することに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
【リボソームの1粒子イメージング】
リボソームの1粒子イメージングを行うための試料調製に成功した。また、X線自由電子レーザーを用いて、ストークタンパク質由来の回折の取得に初めて成功した。
【翻訳リサイクルにおけるストークタンパク質の機能解析】
H29年度は、ストークタンパク質とABCE1の結晶構造を決定することに成功した。さらに、得られた結晶構造モデルを生化学的に検証し、ストークタンパク質との結合に重要なABCE1のアミノ酸残基の同定に成功した。
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| Strategy for Future Research Activity |
以下の研究を行い、翻訳因子のリボソームへの呼び込みに関するストークタンパク質の作用機構を解明する。
【リボソームの1粒子イメージング】
H29年度、X線自由電子レーザーを用いて、ストークタンパク質由来の回折の取得に初めて成功した。一方、リボソームの再構成像を計算するためには、回折の取得効率の向上が必要である。来年度は、この点の改善を試みる。
【翻訳リサイクルにおけるストークタンパク質の機能解析】
生体内での、ストークタンパク質によるABCE1機能促進効果を検証する。そのために、H29年度に同定した、ストークタンパク質との結合に重要なABCE1のアミノ酸残基に変異を導入した出芽酵母を用いて、細胞生育実験とレポーターアッセイを行う。
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