2016 Fiscal Year Annual Research Report
胚発生を制御するシグナルカスケードの要素としての機械的力に関する研究
| Project/Area Number |
16J01027
|
|---|
| Research Institution | Osaka University |
|---|
Principal Investigator |
石橋 朋樹 大阪大学, 理学研究科, 特別研究員(DC1)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2016-04-22 – 2019-03-31
|
| Keywords | 発生学 / メカノバイオロジー / ショウジョウバエ |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
平成28年度は、「力」応答遺伝子の候補遺伝子を目指した。胚を圧迫するなどして、発生で生じる「力」環境を乱すと、力応答遺伝子は、乱された「力」環境に応じて発現変動すると想定される。私は、ショウジョウバエ胚の圧迫システムを作製した。次に、このデバイスを用いてショウジョウバエ胚を圧迫し、ショウジョウバエ胚の「力」環境を乱した。「力」環境を乱した胚からRNAを抽出し、RNA-seq法を用いて、転写産物の定量を行った。Bowtie-Cufflinks法を用いて、圧迫していない胚と圧迫した胚との間で、発現変動解析を行った。これにより、「力」応答遺伝子として21遺伝子を同定した。続いて、「力」応答遺伝子から、3遺伝子を選定し、その発現調節領域下流に、φC31システムを用いた組換えを利用して改変型緑色蛍光タンパク質EGFPでタグ付けした。「力」レポーター系統をライブイメージング解析し、蛍光タグ付けされた「力」応答遺伝子が内在的に発現していることを確認した。また，東海大学の木村啓志博士のグループとともに、胚を部位特異的に圧迫するマイクロデバイスを開発した。このマイクロデバイスにショウジョウバエ胚を導入することで、胚の前方部もしくは後方部に、吸引による「力」を与えることが出来る。私は、このデバイスを用いて胚を吸引することで、胚が変形することを明らかにした。このマイクロデバイスによって、一度に25個の胚に対して、均質な「力」の負荷が可能となった。このデバイスの底部は、カバーガラスで作成されており、「力」を負荷した胚を、共焦点顕微鏡を用いて観察することが可能となる。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成28年度の研究において、胚を圧迫することで発現誘導を受ける遺伝子の候補を20程度同定することができた。これらの遺伝子の内、特に有望なもの3つについて、それぞれの遺伝子発現をGFPレポーター遺伝子で検出出来るようにしたショウジョウバエ系統を作出することに成功した。今後、これらの系統を用いることで、同定した遺伝子の発現が機械的力による刺激によって制御されているがどうかを明らかにできると思われる。また、ショウジョウバエ胚に機械的力を与えるマイクロデバイスのプロトタイプの作製ができた。これらの成果は、当初の計画以上に進捗した。一方、「力」レポーター遺伝子が、「力」依存的に発現変動するかどうかについて、部位特異的な圧迫による確認がまだできていない。これは、当初の計画より遅れている。よって、全体としては、概ね順調に進捗した。
|
| Strategy for Future Research Activity |
平成28年度は、「力」レポーター系統の作出を行った。これにより、「力」レポーターが、部位特異的な「力」負荷によって発現変動するかを、平成29年度に調べる。これは、平成28年度に作製した「力」をショウジョウバエ胚に対して部位特異的に負荷するマイクロデバイスを用いて行う。このデバイスは、一度に25個の胚に対して均質な「力」を負荷でき、また、共焦点顕微鏡による胚の観察が可能である。このため、「力」レポーターを高感度で効率よく観察することが可能である。この方法を用いて、圧迫前と圧迫後で、「力」レポーターの発現レベルや発現部位に変化が生じたかどうかを調べる。
また、平成28年度に作出した「力」レポーター以外の遺伝子についても、蛍光タンパク質タグ付けを行う。「力」レポーター系統の作出システムは、平成28年度の研究により確立されているため、5遺伝子について蛍光タンパク質タグ付けを行うことを計画している。
|
