2017 Fiscal Year Annual Research Report
進化工学と有機合成の融合による革新的蛍光プローブの開発
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16J01710
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| Research Institution | Saitama University |
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Principal Investigator |
寺井 琢也 埼玉大学, 理工学研究科, 特別研究員(SPD) (00508145)
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| Project Period (FY) |
2016-04-22 – 2019-03-31
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| Keywords | 進化分子工学 / ペプチド化学 / 蛍光センサー / 合成化学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
「タンパク質と結合することで蛍光特性が変化するペプチド型プローブ開発」に関しては以下の検討を行った。血清アルブミンを標的タンパク質とし、DTT還元により切断可能な共有結合リンカーを用いて磁気ビーズ上に固定した。アプタマーの候補ライブラリとしては、蛍光分子と反応させるためのCysに続いて12種類のランダムアミノ酸をバランスよく呈示するNDTコドンが9つ連続するDNAを用意した。これを転写・無細胞翻訳してcDNA display分子を作製し、チオール反応性の環境感受性蛍光色素と反応させた。その後Hisタグ精製を行って未反応色素を除去し、BSA固定化ビーズとのインキュベーション、洗浄、溶出を行った。実験条件を適宜変更しつつ合計７回のin vitro selectionを実施した。
また加水分解酵素基質の網羅的探索については以下の実験を行った。前年度に報告した方法では実験系がうまく機能していないことが分かったため、ビーズへの固定化ではなく液相中で直接display分子とプロテアーゼを反応させて、電気泳動によって反応分子・未反応分子を分離する手法を試みた。その結果、系自体は機能したものの濃縮率（＝S/N）が不十分で実用性に欠けることが明らかとなった。次に、cDNA display分子をビオチン修飾するのではなく、遺伝子的に付加したHisタグペプチドによってNiビーズに固定化する方法を検討した。その結果、Factor Xaをモデル酵素とした場合、反応条件を適切に設定すればビーズ上での酵素反応が期待通り進行し、酵素で切断される配列のみを上清中に回収できることが分かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初設定した４つの研究目的に対して、１つは既に達成済みであり２つは現在検討中である。申請段階では想定していなかった技術的な課題が多く見つかりその解決に時間を要したため、２つとも十分にまとまった成果が得られている段階ではないものの、「研究実績の概要」で述べたようにライブラリ構築は既に終了しており、最も重要かつ労力を必要とする検討項目であるセレクション系の構築についても概ね目処が付いた状態である。申請段階では考えていなかった新たな知見も得られているため、全体的には順調に研究が進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
「タンパク質と結合することで蛍光特性が変化するペプチド型プローブ開発」に関しては、一つのコンパートメント上に多数の同一ペプチドを提示可能な得られた細胞表層display技術との併用を図る。具体的には共同研究により、プラスミド（ライブラリ）にコードされたポリペプチドを出芽酵母等の表面に発現させる。そして前述のセレクションによって絞り込まれたアプタマー候補DNAを使ってFACS（fluorescence-activated cell sorter）を用いた蛍光強度に基づく酵母の選別を行う。
加水分解酵素基質の網羅的探索については、まずpositive controlとnegative controlでの実験を行って適切なセレクション条件を設定する。続いてランダム配列からのセレクション及び次世代シークエンスによる網羅的解析を実施したい。
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