進化工学と有機合成の融合による革新的蛍光プローブの開発

2018 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 16J01710
• Research Institution: Saitama University
• Principal Investigator: 寺井 琢也 埼玉大学, 理工学研究科, 特別研究員(SPD) (00508145)
• Project Period (FY): 2016-04-22 – 2019-03-31
• Keywords: 進化分子工学 / ペプチド化学 / 蛍光センサー / 合成化学

Outline of Annual Research Achievements

前年度までに確立したcDNA display技術を活用して、引き続き蛍光修飾ペプチドライブラリを使った「標的タンパク質に結合することで発光特性が変わる蛍光プローブ」および「プロテアーゼに対する特異的発蛍光基質」の開発を行った。
前者に関しては、各候補ペプチド配列の「蛍光変化」を直接検出可能なフローサイトメーター（FACS）評価系を利用した2段階セレクションシステムを立ち上げるため、ペプチドライブラリをコードするＤＮＡを酵母発現用のプラスミドに導入し、酵母表面に候補ペプチドを発現させて蛍光修飾した。続いてFACSで個別の蛍光を測定・分取することによりセレクションを行った。しかし、細胞表面の内在性タンパク質の影響が予想より大きくＳ／Ｎの良いセレクションを実施する事は出来なかった。そこでマイクロビーズ表面にＤＮＡとペプチドを修飾する新たな系を構築することを試みた。種々の条件検討の結果、２種類のモデルＤＮＡを別々のビーズ上に結合させ、夫々に対応するペプチドを当該ビーズ上に固定して分取することに成功した。
また後者においては、プロテアーゼによって切断を受けたペプチド配列をセレクションするシステムの構築に前年度の研究で概ね成功している。そこで今年度は更に条件検討を進め、実際にランダムライブラリからの基質セレクションを行った。その結果、セリンプロテアーゼおよびシステインプロテアーゼに対して効率よく酵素反応を受けるペプチド配列を濃縮し、次世代シークエンス解析によって基質配列に関する知見を得ることができた。

Research Progress Status

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Selection of peptides that associate with dye-conjugated solid surfaces in a pH-dependent manner using cDNA display (2019)
  • Author(s): Takuya Terai, Hiroki Anzai, and Naoto Nemoto
  • Journal Title: ACS Omega Volume: 4 Pages: 7378～7384
  • DOI: 10.1021/acsomega.9b00631
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Synthesis of unsymmetrical Si-rhodamine fluorophores and application to a far-red to near-infrared fluorescence probe for hypoxia (2018)
  • Author(s): Kenjiro Hanaoka, Yu Kagami, Wen Piao, Takuya Myochin, Koji Numasawa, Yugo Kuriki, Takayuki Ikeno, Tasuku Ueno, Toru Komatsu, Takuya Terai, Tetsuo Nagano, and Yasuteru Urano
  • Journal Title: Chemical Communications Volume: 54 Pages: 6939～6942
  • DOI: 10.1039/c8cc02451k
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Development of a Series of Practical Fluorescent Chemical Tools To Measure pH Values in Living Samples (2018)
  • Author(s): Shodai Takahashi, Yu Kagami, Kenjiro Hanaoka, Takuya Terai, Toru Komatsu, Tasuku Ueno, Masanobu Uchiyama, Ikuko Koyama-Honda, Noboru Mizushima, Tomohiko Taguchi, Hiroyuki Arai, Tetsuo Nagano, and Yasuteru Urano
  • Journal Title: Journal of the American Chemical Society Volume: 140 Pages: 5925～5933
  • DOI: 10.1021/jacs.8b00277
  • Peer Reviewed
• [Presentation] cDNA display法を用いた夾雑環境下での試験管内淘汰 (2019)
  • Author(s): 安齋 宏紀、根本 直人、寺井 琢也
  • Organizer: 日本化学会第99春季年会
• [Presentation] In vitro selection of peptide aptamers that recognize a specific conformation of an organic dye (2019)
  • Author(s): 寺井 琢也、安齋 宏紀、山田 陸、根本 直人
  • Organizer: 日本化学会第99春季年会
• [Presentation] 進化分子工学による低分子認識ポリペプチドの開発 (2019)
  • Author(s): 寺井 琢也、安齋 宏紀、山田 陸、根本 直人
  • Organizer: Future Trend in Polymer Science 2018
• [Presentation] pH応答型タンパク質精製システムを目指した低分子結合ペプチドの探索研究 (2018)
  • Author(s): 山田 陸、安齋 宏紀、寺井 琢也、根本 直人
  • Organizer: 第41回日本分子生物学会年会
• [Presentation] cDNA display法を用いたプロテアーゼの基質探査法の開発 (2018)
  • Author(s): 藤谷 聡、寺井 琢也、根本 直人
  • Organizer: 第41回日本分子生物学会年会
• [Presentation] Development of Phenolphthalein Binding Peptide Aptamers Using cDNA Display (2018)
  • Author(s): Hiroki Anzai, Riku Yamada, Takuya Terai, Naoto Nemoto
  • Organizer: 10th International Peptide Symposium
  • Int'l Joint Research
• [Remarks] 埼玉大学工学部応用化学科根本研究室ホームページ
  • URL: http://park.saitama-u.ac.jp/~nemoto/
• [Patent(Industrial Property Rights)] 分子精製用リガンド、分子精製用タグペプチド及びこれらを用いた分子精製方法 (2018)
  • Inventor(s): 根本直人、寺井琢也、安齋宏紀、山田陸
  • Industrial Property Rights Holder: 埼玉大学
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 特願2018-162831