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2017 Fiscal Year Annual Research Report

細菌べん毛モーターの回転力産生のための構造的基盤の解明

Research Project

Project/Area Number 16J01859
Research InstitutionOsaka University

Principal Investigator

竹川 宜宏  大阪大学, 理学研究科, 特別研究員(PD)

Project Period (FY) 2016-04-22 – 2019-03-31
Keywordsべん毛 / べん毛モーター / 固定子 / 回転子 / メカノセンサー
Outline of Annual Research Achievements

Aquifex aeolicus由来の固定子タンパク質MotAについて、高い再現性で多様な結晶が得られた。SPring-8におけるX線回折実験により低分解能ではあるが回折像が得られている。今後、より条件を最適化していくことでMotAの高分解能構造決定に取り組む。
A. aeolicus由来のFliFの部分断片(FliF(58-213))を、X線構造解析により2.3オングストロームの分解能で構造を決定した。同FliF断片が有する二つのドメイン(ドメインI、ドメインII)がそれぞれ、III型分泌装置構成因子PrgH内のドメインやPrgK/EscJ内のドメインと、構造的な類似性を示すことから、FliFのリングモデルを構築した。変異体解析から、構造中のジスルフィド結合の重要性や、β4-β5間のループ部分がFliFリング形成には影響しないがFlhAが集合するための相互作用部位であることを明らかにした。
Vibrio alginolyticusにおいて、べん毛モーター構成タンパク質の一つFliLが高粘性下でのモーター機能に必須であることを明らかにした。FliLのペリプラズムフラグメント(FliLp)の結晶構造をX線構造解析により2.1オングストローム、3.4オングストロームの分解能で決定した。FliLpは結晶中でリング状あるいはチューブ状の集合体を形成し、変異体解析からこのリング状の相互作用がFliLの機能のために重要であることを明らかにした。またFliLが固定子と相互作用するためには固定子が持つペリプラズムリンカーの長さが重要であることから、FliLが固定子を取り囲み、固定子-FliL複合体を形成して機能するモデルを提唱した。FliLは機械刺激応答因子として知られるSPFHファミリーと構造的な類似性を持ち、FliLが機械刺激依存的に固定子のイオンチャネル活性や活性化を制御する可能性が示唆された。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の予定通り、回転子タンパク質FliFの構造を元にした変異体解析から、FliFの構造-機能相関を明らかにすることに成功した。MotAに関してはナノディスクへの再構成・クライオ電子顕微鏡観察による構造解析が進展している。
また、新規にFliLのX線結晶構造解析に成功しており、構造を元にした変異体解析から、これまで予想されていなかった新規のべん毛モーター機能のモデルを提唱した。
これら以外に、べん毛の数を制御する因子SflAの細胞内局在を観察し、SflAが極局在タンパク質HubP依存的にべん毛基部に局在し、特に細胞質側に位置するのC末端側ドメインがべん毛形成を阻害する能力があることを示した。また、べん毛モーターの回転力を発生するためには固定子-回転子間に存在する荷電残基とべん毛モーターの回転方向の関係性について解析し、固定子内の荷電残基は両回転方向に等しく寄与すること、回転子の構造を不安定化させる変異により回転能力に偏りが生じることを明らかにするなど、研究の進捗として順調に進展しているといえる。

Strategy for Future Research Activity

固定子タンパク質MotAの精製条件・結晶化条件・変異導入部位の最適化、高分解能X線回折測定を継続して行う。同時にナノディスクへの再構成・クライオ電子顕微鏡観察による異なるアプローチ方法による構造解析も継続する。得られた構造を元に変異体を作成し、過去に確立したキメラMotA大腸菌機能解析系を用いることで、べん毛モーター固定子の構造-機能相関を明らかにし、べん毛モーターの回転力発生機構・エネルギー変換機構に関して分子レベルでのメカニズムを解明する。
回転子タンパク質FliFに関しては、変異体作成を継続して行い、構造-機能相関をより詳細に明らかにする。
FliLに関しては現在すでに構造決定した極べん毛FliLに加えて側べん毛FliLの構造解析を行い、同時に構造を元に変異体を作成することで、現在提唱している新規モデルの信頼性をより確固たるものにする。

  • Research Products

    (10 results)

All 2018 2017 Other

All Journal Article (2 results) (of which Peer Reviewed: 2 results,  Open Access: 2 results) Presentation (6 results) Remarks (2 results)

  • [Journal Article] The role of conserved charged residues in the bidirectional rotation of the bacterial flagellar motor2018

    • Author(s)
      Yasuhiro Onoue, Norihiro Takekawa, Tatsuro Nishikino, Seiji Kojima, Michio Homma
    • Journal Title

      Microbiologyopen

      Volume: 24 Pages: e00587

    • DOI

      10.1002/mbo3.587

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Localization and domain characterization of the SflA regulator of flagellar formation in Vibrio alginolyticus2017

    • Author(s)
      Satoshi Inaba, Takehiko Nishigaki, Norihiro Takekawa, Seiji Kojima, Michio Homma
    • Journal Title

      Genes to Cells

      Volume: 22(7) Pages: 619-627

    • DOI

      10.1111/gtc.12501

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Presentation] 細菌べん毛モーター機能を補助するタンパク質FliLのX線結晶構造解析2018

    • Author(s)
      竹川宜宏、伊角実優、朱世偉、佐久間麻由子、小嶋誠司、本間道夫、今田勝巳
    • Organizer
      第5回生命分子科学研究会
  • [Presentation] べん毛モーター固定子付随タンパク質FliLのリング構造2018

    • Author(s)
      竹川宜宏、伊角実優、朱世偉、佐久間麻由子、小嶋誠司、本間道夫、今田勝巳
    • Organizer
      2017年度べん毛研究交流会
  • [Presentation] べん毛モーターMSリングの内側部位を形成するFliF断片の構造解析2017

    • Author(s)
      竹川宜宏、佐久間麻由子、小嶋誠司、本間道夫、今田勝巳
    • Organizer
      第14回21世紀大腸菌研究会
  • [Presentation] Structure of a periplasmic fragment of FliL, a bacterial flagellar stator associated protein from Vibrio alginolyticus2017

    • Author(s)
      竹川宜宏、伊角実優、佐久間麻由子、小嶋誠司、本間道夫、今田勝巳
    • Organizer
      第55回日本生物物理学会年会
  • [Presentation] FliLは細菌べん毛モーター固定子を制御するメカノセンサーか?2017

    • Author(s)
      竹川宜宏、伊角実優、朱世偉、西野優紀、佐久間麻由子、小嶋誠司、本間道夫、今田勝巳
    • Organizer
      2017年度生命科学系学会合同年次大会
  • [Presentation] べん毛モーター固定子を取り巻くタンパク質FliLの構造・機能解析2017

    • Author(s)
      竹川宜宏、伊角実優、朱世偉、佐久間麻由子、小嶋誠司、本間道夫、今田勝巳
    • Organizer
      日本生体エネルギー研究会第43回討論会
  • [Remarks] 第29回論文紹介 名古屋大学大学院理学研究科 生命理学専攻・理学部 生命理学科

    • URL

      http://www.bio.nagoya-u.ac.jp/paper/2017-29/12.html

  • [Remarks] 第30回論文紹介 名古屋大学大学院理学研究科 生命理学専攻・理学部 生命理学科

    • URL

      http://www.bio.nagoya-u.ac.jp/paper/2017-30/16.html

URL: 

Published: 2018-12-17  

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