2016 Fiscal Year Annual Research Report
生命を維持するＤＮＡ複製装置はどのように形成されてきたか～アーキア研究から迫る～
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16J02633
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
永田 麻梨子 九州大学, 生物資源環境科学府, 特別研究員(DC1)
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2016-04-22 – 2019-03-31
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| Keywords | アーキア / 超好熱菌 / DNA複製 / ヘリカーゼ / タンパク質間相互作用 / 遺伝学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
アーキアと真核生物の複製装置は同じ祖先から進化したと考えられる。DNA複製中に二本鎖を開裂するヘリカーゼ複合体の構造と機能発現の分子機構を解明するため、超好熱性アーキアThermococcus kodakarensisを用いて進めた。
複製ヘリカーゼ複合体構成因子であるMCM, GINSはアーキアと真核生物に共通であるが、３つめの因子であるCdc45の構造と機能の理解が望まれる。これに相当すると予想したアーキアのGANについて詳細に解析した結果、真核生物と同様に細胞内においてMCM、GINSと同一複合体内に存在し、試験管内でも機能的複合体を形成することを見出したが、詳細な因子同士の相互作用様式が真核生物と異なっていた。さらに、GANとGINSとの相互作用様式を、結晶構造とアミノ酸変異体実験から詳細に解析した。
真核生物のCdc45はヌクレアーゼ活性を有しないことが報告されているが、GANは試験管内で明瞭なヌクレアーゼ活性を示した。しかし、細胞内の無機元素濃度を測定し、試験管内でその濃度を反映させて酵素活性を調べた結果、ヌクレアーゼ活性は検出されなかった。GANはアーキア細胞内でレプリソームに存在するもののヌクレアーゼとしては機能しないのではないかと考えられる。
次にGANの遺伝子欠損株の特徴を調べると、特異的生育遅延が観察された。さらに、至適生育温度よりも高温では生育できない高温感受性を示すことが明らかとなった。真正細菌におけるホモログであるRecJは紫外線損傷時のDNA修復に重要であることがわかっているが、GAN遺伝子欠損株は紫外線感受性を示さなかった。
以上の結果から、GANは T. kodakarensisのDNA複製過程において必須の因子ではないが、（真核生物のCdc45は生育に必須）、レプリソームの安定性と複製フォークの進行速度に関わる重要な役目を担っていると考察した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
超好熱性アーキアの試験管内DNA複製再構成に向けて、複製ヘリカーゼ複合体(GAN-MCM-GINS)およびその構成因子であるGAN (Cdc45/RecJ)の構造と機能の詳細な解析を進め、GAN分子の構造と機能、および分子進化について議論した。この結果は国際誌に発表した。さらに、GAN分子の機構について解析を進め、アーキア細胞内で複製複合体構成因子として存在すること、超好熱菌の生育にとって重要な役目を担うことを解明した。これらの結果を論文にまとめたので、近日投稿予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
複製過程で実際に働くヘリカーゼ複合体の中でのGAN分子の役割を解明するため、二本鎖DNAの解離速度を正確に測定できる実験系を構築し、GAN分子の有無による違いを調べる。そのために、ポリメラーゼとPCNAクランプを用いてヘリカーゼの開裂後に合成された新生鎖の量・長さから複製ヘリカーゼ複合体のDNA開裂速度を調べる基礎実験を進めている。
また、T. kodakarensisにはもうひとつCdc45/RecJのホモログ因子が存在し、そのタンパク質の機能解析を進めた結果、この分子が複製フォーク進行阻害時の修復で重要な働きを担うと予想しているHef タンパク質と特異的相互作用をすることからHANと名付けた。HANについても、GANとの比較実験により、HANはGANとは相補せず、修復因子との機能的な相互作用と細胞内での共局在性なと、その基礎的な性質と特性を理解するためのデータが得られているので、この因子の意義と細胞内で相互作用しているタンパク質を同定し、GANとは異なるHANの意義をまとめて論文投稿する。
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