2017 Fiscal Year Annual Research Report
天然基質の官能基の一部として誤認識される小分子を用いた酵素の誤作動と酵素反応制御
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16J02846
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
小野田 浩宜 名古屋大学, 理学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2016-04-22 – 2019-03-31
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| Keywords | 生体触媒 / 基質誤認識 / シトクロムP450 / ペルオキシゲナーゼ / 酸化反応 / 反応場制御 / 過酸化水素 / バイオ燃料 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度までに、好熱性細菌Exiguobacterium sp. AT1bから発見されたCYP152N1の発現系、精製手法、結晶構造解析に成功していた。この酵素は、数～数十μMの過酸化水素を等量的に用いて、脂肪酸のα-位を(S)-選択的に水酸化する事を確認していた。また、高濃度の酢酸存在下で酵素を誤作動させると、スチレンの酸化反応を触媒する事も発見していた。酵素が誤作動して、脂肪酸以外の基質を酸化する条件下では、過酸化水素の認識が緩くなり、高い触媒活性を引き出すために、数mM程度の過剰な過酸化水素が必要であると気付いた。そこで、CYP152N1に過剰量（5 mM）の過酸化水素を加えて、炭素数14の脂肪酸であるのミリスチン酸の酸化反応を行うと、わずか1分間で、1つ炭素が少ないトリデカン酸が主生成物として得られた。20分間反応を継続すると、炭素数10のデカン酸が主生成物として得られた。分子動力学計算や酸素同位体標識を用いた実験からCYP152N1はα-ヒドロキシ脂肪酸やα-ケト脂肪酸を経由して脂肪酸の炭素鎖を短くできる事を明らかにし、報告した。この高濃度の過酸化水素を用いる脂肪酸の鎖長制御法は、脂肪酸から末端アルケンを合成できるCYP152A1にも適応可能であり、今後の研究次第では、微生物に存在する長鎖脂肪酸から、ガソリンに適した中鎖炭化水素を合成できると期待している。
同様に脂肪酸を水酸化するCYP102A1の変異体に対して、脂肪酸と同様に認識されるパーフルオロアルキルアシルアミノ酸を添加すると、ほとんどのケースでシクロアルカンの水酸化活性が向上する事を報告した。シクロアルカンの酸化活性が向上しなかった変異体に対し、シクロアルカンとパーフルオロアシルアミノ酸のドッキングシミュレーションを行い、パーフルオロアシルアミノ酸がCYP102A1に与える影響を説明した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
本申請課題では、酵素を誤作動させる事で酵素機能を拡張する事を主題としている。これまでに、長鎖脂肪酸ペルオキシゲナーゼが酢酸存在下で誤作動し、スチレンやメトキシナフタレンといった非天然基質の酸化活性を示す事を報告し、長鎖脂肪酸ペルオキシゲナーゼの活性部位にカルボキシル基を持つグルタミン酸を変異導入する事で、酢酸を用いた場合と同様な誤作動を再現できる事を報告している。さらに、過酸化水素濃度を向上させることで長鎖脂肪酸ペルオキシゲナーゼが誤作動し、長鎖脂肪酸水酸化反応とは異なる脂肪酸のα-酸化的脱炭酸反応を触媒する事を報告した。近年、長鎖脂肪酸ペルオキシゲナーゼは脂肪酸からアルケンを合成出来る事が報告され、バイオ炭化水素合成酵素として着目されている。同種の酵素を用いて脂肪酸の鎖長制御が可能になった本報告は、脂肪酸ペルオキシゲナーゼを汎用的な酸化触媒として用いる当初の計画に加え、脂肪酸ペルオキシゲナーゼのバイオ燃料酵素としての応用化に繋がる革新的な技術となり、当初の計画以上に研究が進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究で用いているCYP152N1やCYP152A1は脂肪酸から末端アルケンを合成する活性が低いという問題がある。当研究室で発現系を保持していないCYP152ファミリー酵素であるCYP152L1やCYP152P1の発現系を構築し、CYP152L1やCYP152P1を誤作動させることで、バイオ燃料として適切な鎖長を持つ末端アルケンの生成にも取り組む。
本申請課題では、CYP152ファミリー酵素以外の酵素を誤作動させる事も目標としており、シトクロムP450レダクターゼや一酸化窒素合成酵素の誤作動に取り組む。
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Research Products
(7 results)
