2016 Fiscal Year Annual Research Report
５－ブロモウラシルを用いたＤＮＡ内電子移動のｉｎ ｖｉｖｏ検知手法の確立
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16J03092
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
橋谷 文貴 京都大学, 理学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2016-04-22 – 2019-03-31
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| Keywords | DNA内電子移動 / 5-ブロモウラシル / Chem-Seq / 光反応 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
申請者が所属する研究室ではDNA鎖に5-ブロモウラシル（以下BrU）を組み込み、DNA内電子移動の検知やDNA-タンパク質相互作用の研究を行っている。BrUは電子移動によって還元されウラシルラジカルを生じるため、申請者は紫外線照射によって誘起されたDNA内電子移動をウラシルラジカルからの生成物（主にウラシル）として検知してきた。
申請者はこれまで数百bp程度のDNAで行われてきたBrUによる電子移動検知を、ゲノムDNA（以下gDNA）で行うことを試みている。これにより生体機能にかかわる重要なDNA内電子移動の検知や細胞レベルでのDNA-タンパク質相互作用の確認ができるようになると期待される。
申請者はgDNA中のウラシルを化学修飾し、精製した後にNGSで解析することでウラシル塩基生成部位の特定を行った。ウラシルの化学修飾はサンプルをUracil DNA Glycosylase（以下UDG）とAldehyde reactive probe（以下ARP）で処理しウラシル部位を選択的にビオチン化することで達成した。BrU置換gDNAに紫外線を照射しUDGとARP処理の後にビオチン化DNAの精製を行うと、紫外線照射を行わなかったgDNAと比べて有意にDNAが回収でき、これをNGSで解析するとgDNAの特定領域のDNAが高効率で回収されたことが判明した。モチーフ解析を行うとこれらの領域には5'-dCBrUBrUABrU(G/C)-3'という配列が含まれていることがわかった。興味深いことにあらかじめ断片化したDNAに紫外線照射を行った場合この配列は確認できず、またこの配列を含む8 bpのDNAオリゴでも際立ったウラシルラジカルの生成が確認できなかったことから、DNA鎖のねじれによる高次のらせん構造などgDNA特有の構造依存的なウラシルラジカル生成であることが予想される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
申請時の計画では１年目においてBrU置換gDNAの調製、BrUが取り込まれないgDNA領域の特定およびgDNA中のウラシル生成部位特定方法の確立を目標とした。
申請者はチミンの合成経路を欠損した大腸菌変異株HL946株にBrUを加えて培養し抽出することでチミンの80%がBrUで置換されたgDNAを得ることに成功した。
またgDNA中のウラシル生成部位の特定に関してもウラシルをUDGによって除去してAP siteを生成し、これをARPで処理することによりビオチン化修飾を施し、NGSによるChem-seqで解析することで達成した。
BrUが取り込まれない領域の特定に関しては達成されていないもののすでにBrUに対する抗体は用意しておりChIP-seqで解析をすることにより特定の目途はたっている。
以上から目標はどれも達成、もしくは達成の目途が立っている状態であり、これらを踏まえて申請者の研究の現在までの進捗状況はおおむね順調に進展しているといえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
申請者の第1年目の研究からDNA鎖のねじれによる高次のらせん構造といったgDNA特有の構造がBrUを含むDNAでの光反応に関係していることが示唆された。特に5'-dCBrUBrUABrU(G/C)-3'という配列ではDNAの高次構造依存的に光反応を起こす可能性が高い。そこで申請者はDNAの高次構造と光反応の関係性を検討するためにヌクレオソームを構成し、これにおける光反応を確認することを予定している。
具体的にはBrUでチミンを置換した601配列とヒストン八量体からヌクレオソームを再構成しこれに紫外線照射を行ってからウラシルの生成を確認する。既にタンパク質発現用大腸菌BL21株を用いてヒストン八量体を構成することには成功しており、601配列のような短いDNAにおけるウラシル生成部位の特定は申請者のこれまでの研究で達成されている。最終的には601配列に5'-dCBrUBrUABrU(G/C)-3'配列を組み込んだものを調製し、これを使って再構成したヌクレオソーム上での光反応を検討する。
またHL946のgDNAのチミンの20%程度はBrUに置換されない問題についてはこれまで通りBrUで置換できない領域があると仮定してanti-BrU抗体を使ったChIP-seqによってHL946のgDNAを分析し、BrUで置換できない領域の特定を試みる。
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